mPTP在心肌线粒体氧化应激损伤诱导细胞凋亡的研究进展(2)
2 mPTP结构
现有研究发现，线粒体膜的通透性与其结构功能关系密切，与MIRI也有着密不可分的联系。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是线粒体内膜与外膜之间的非特异性高导电性的通道，主要通过控制心肌细胞的氧化磷酸化来调控能量代谢，调节线粒体膜的通透性，维持内外离子的相对恒定，对形成稳定的电势差和维持膜电位的稳定有重要作用[6]。
mPTP为一种多蛋白的复合体结构，但是其具体结果尚不明确，现在学界普遍认为其主要成分为线粒体内膜上的腺苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)，线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，线粒体基质中的亲环素D(cyclophilin D，Cyp D)[7]。ANT主要催化细胞质中的ADP与线粒体中ATP转换，为mPTP的非必需成分；VDAC是一种重要的跨膜蛋白，对于控制一些能量代谢物质如ADP与ATP进入线粒体进行相互转化非常重要，还可以促进Bcl-2家族中的一些促凋亡的蛋白与线粒体的外膜相互结合，介导Cyt C的释放进而导致线粒体依赖的细胞内源性凋亡[8]；Cyp D是免疫抑制药环孢素(例如环孢素A)在细胞内的一类蛋白结合位点，其活性受Ca2+浓度的调节，细胞内高Ca2+时介导mPTP的开放，对于Cyp D是否是mPTP的重要成分尚存在疑问[9]。
, 百拇医药
3 mPTP的功能
线粒体mPTP的结构和功能直接影响着心肌细胞的功能，心肌细胞线粒体上的mPTP的病理性开放是MIRI中不可避免关键因素，线粒体基质肿胀和线粒体mPTP长时间开放可以导致线粒体呼吸传递链抑制，膜电位下降，膜间正离子集聚等系列病理性变化。
mPTP有三种开闭状态：线粒体的跨膜电位完整时的完全关闭的状态；可以传导电信号和钙信号的较低水平的可逆性的开放状态；导致心肌细胞的不可逆变化甚至凋亡的高水平的不可逆开放状态[10]。
4 mPTP在凋亡中的作用
mPTP引起凋亡的大体机制如下：三羧酸循环终止，引起外膜破碎，释放Cyt C，活化caspase系列蛋白，通过caspase依赖机制使心肌细胞走向凋亡[11]。氧化应激、线粒体内Ca2+超载、线粒体内膜电位降低、ROS大量生成，无机磷酸盐、NO等物质都会导致线粒体mPTP的病理性开放。现有研究表明氧化应激反应是MIRI中引起心肌细胞损伤非常重要的因素之一，可以使线粒体mPTP上的结构蛋白发生构象改变，进而导致线粒体通透性异常，mPTP病理性开放，激发下游通路，导致不可逆损伤，最终引发心肌细胞凋亡[12]。
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线粒体mPTP因外界或病理条件大量开放时，细胞内乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)活性明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性显著下降，ROS与MDA大量生成，线粒体内的Cl-浓度升高，胞内Ca2+超载明显，引起线粒体膜电位崩溃，氧化磷酸化脱耦联，ATP生成障碍。而一些凋亡因子例如Cyt C释放后，激活caspase相关的凋亡蛋白。
Cyt C是线粒体呼吸链中复合体Ⅲ、 Ⅳ的重要组成部分，为一种细胞核核基因编码的水溶性蛋白质，对细胞的能量代谢有着十分重要的作用，其位于线粒体内膜的外侧，分子量在12 kDa左右，可以传导和放大凋亡型号，是心肌细胞凋亡的重要调控因子[13]。近年来对Cyt C的研究已经从控制细胞的代谢过程发展到了探讨其对细胞凋亡的影响。在凋亡过程中线粒体不仅丧失氧化产能的功能，更加重要的是由线粒体mPTP调控和释放Cyt C控制的细胞凋亡过程被激活[14]。Cyt C可以在ATP/dATP存在的条件下与蛋白酶活化因子进行结合而形成多聚体结构，进一步活化caspase-9，而caspase-9作为凋亡的启动者，释放之后收到信号便开始通过自剪和接合的方式激活，但是caspase-9并不能降解细胞本身的蛋白质，而是通过caspase级联反应来进一步活化下游不具有自我激活的能力的casepase-3，引起一系列连锁反应[15]。caspase-3活化之后作为凋亡的执行者，直接作用于损伤的心肌细胞，破坏细胞内多种重要结构和功能蛋白，使其进一步降解为凋亡小体，引起心肌细胞凋亡[16]。因此将线粒体mPTP的开放程度降低或抑制mPTP的病理性开放可以有效地保护心肌细胞，避免心肌细胞的凋亡，进一步保护心脏功能的正常行使。
, http://www.100md.com
5 线粒体mPTP调控作用的两种可能机制
5.1 VDAC假说 有些研究认为VDAC是一种位于细胞线粒体外膜保守的孔道蛋白，可以在线粒体膜上形成亲水性的电压依赖通道，是线粒体与细胞质之间的主要物质交换通道，将内膜和外膜一分为二，是调控心肌细胞凋亡的重要节点[17]。VDAC对线粒体内外的物质运输有着重要的作用，VDAC蛋白结构的动态变化是VDAC关闭和开放的重要原因，因此在mPTP的开闭中也承担着重要角色。其中VDAC就控制着Cl-的跨线粒体膜的运输，Cl-是细胞中具有非常重要的生理意义的阴离子，其浓度的异常变化会影响细胞的内环境的pH，而pH又可以影响到膜信号的转导、Ca2+的稳态、兴奋—收缩耦联机制、生长代谢等一系列生理过程[18]。通过削弱“氯增加诱发钙小体释放机制”的触发作用，可以有效地减轻氧化应激反应，钙超载，维持线粒体膜电位的相对稳定，抑制Cyt C的病理性释放和caspase系列凋亡蛋白的激活，最后减少心肌细胞的凋亡[19]。文献[20]显示，4，4’-二异硫氰基芪-2，2’-二磺酸(4，4’-diisothiocyanostilbene-2，2’-disulfonicacid，DIDS)可以取消线粒体膜电位的震荡，也可以特异性的阻断VDAC，关闭线粒体mPTP。当除去细胞外的Cl-或者是加入Cl-阻断剂DIDS后可以减轻心肌细胞的损伤程度并减少心肌细胞的凋亡，VDAC还可以通过闭合mPTP来阻断ADP进入线粒体内，间接阻断ATP的合成和流动，因此还可以影响细胞能量的产生[21]。线粒体通透性的改变需要内膜和外膜的同时改变，外膜上的某些特定区域可以作為它们相互作用的接触位点，可以与胞内多种蛋白结合，而VDAC就是细胞质与外膜进行结合的位点。VDAC1是VDAC的三种亚型之一，控制物质运输，与Bcl-2家族蛋白互相作用之后可以改变线粒体外膜的通透性，导致Cyt C的释放及其他相关的凋亡因子进入胞浆，引起心肌细胞的凋亡[22]。用RNAi特异性的沉默VDAC1之后，心肌细胞的氧化应激反应减弱，钙离子超载程度减轻，保护了线粒体的膜电位，线粒体mPTP的开放程度有一定的削弱，线粒体中Cyt C的释放被抑制及活化的caspase-9，caspase-3等系列凋亡蛋白含量显著减少[23]。正常的情况下Cyt C是无法通过线粒体外膜的，Cyt C的释放受到VDAC与Bcl-2之间反应的影响，一些位于细胞内的促凋亡因子如Bax以及Bak等与VDAC结合后，增强了VDAC的活跃程度，促进了线粒体mPTP的开放。VDAC的高表达使其由单体形式向低聚体的形式转变，形成了巨大的孔道，这使得内膜区的凋亡因子得以释放，如Cyt C释放[24]。VDAC的高表达还增加了ROS的生成量，加重了氧化应激反应程度，使细胞的凋亡程度加重。而一些抗凋亡因子例如Bcl-2以及Bcl-xl位于线粒体的外膜上，可以和VDAC直接接触并结合发生反应而使得VDAC得以关闭，进而抑制Cyt C的释放[25]。, http://www.100md.com(韩学超 徐森 徐菁蔓)
现有研究发现，线粒体膜的通透性与其结构功能关系密切，与MIRI也有着密不可分的联系。线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是线粒体内膜与外膜之间的非特异性高导电性的通道，主要通过控制心肌细胞的氧化磷酸化来调控能量代谢，调节线粒体膜的通透性，维持内外离子的相对恒定，对形成稳定的电势差和维持膜电位的稳定有重要作用[6]。
mPTP为一种多蛋白的复合体结构，但是其具体结果尚不明确，现在学界普遍认为其主要成分为线粒体内膜上的腺苷酸转运蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)，线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，线粒体基质中的亲环素D(cyclophilin D，Cyp D)[7]。ANT主要催化细胞质中的ADP与线粒体中ATP转换，为mPTP的非必需成分；VDAC是一种重要的跨膜蛋白，对于控制一些能量代谢物质如ADP与ATP进入线粒体进行相互转化非常重要，还可以促进Bcl-2家族中的一些促凋亡的蛋白与线粒体的外膜相互结合，介导Cyt C的释放进而导致线粒体依赖的细胞内源性凋亡[8]；Cyp D是免疫抑制药环孢素(例如环孢素A)在细胞内的一类蛋白结合位点，其活性受Ca2+浓度的调节，细胞内高Ca2+时介导mPTP的开放，对于Cyp D是否是mPTP的重要成分尚存在疑问[9]。
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3 mPTP的功能
线粒体mPTP的结构和功能直接影响着心肌细胞的功能，心肌细胞线粒体上的mPTP的病理性开放是MIRI中不可避免关键因素，线粒体基质肿胀和线粒体mPTP长时间开放可以导致线粒体呼吸传递链抑制，膜电位下降，膜间正离子集聚等系列病理性变化。
mPTP有三种开闭状态：线粒体的跨膜电位完整时的完全关闭的状态；可以传导电信号和钙信号的较低水平的可逆性的开放状态；导致心肌细胞的不可逆变化甚至凋亡的高水平的不可逆开放状态[10]。
4 mPTP在凋亡中的作用
mPTP引起凋亡的大体机制如下：三羧酸循环终止，引起外膜破碎，释放Cyt C，活化caspase系列蛋白，通过caspase依赖机制使心肌细胞走向凋亡[11]。氧化应激、线粒体内Ca2+超载、线粒体内膜电位降低、ROS大量生成，无机磷酸盐、NO等物质都会导致线粒体mPTP的病理性开放。现有研究表明氧化应激反应是MIRI中引起心肌细胞损伤非常重要的因素之一，可以使线粒体mPTP上的结构蛋白发生构象改变，进而导致线粒体通透性异常，mPTP病理性开放，激发下游通路，导致不可逆损伤，最终引发心肌细胞凋亡[12]。
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线粒体mPTP因外界或病理条件大量开放时，细胞内乳酸脱氢酶(LDH)和磷酸肌酸激酶(CPK)活性明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性显著下降，ROS与MDA大量生成，线粒体内的Cl-浓度升高，胞内Ca2+超载明显，引起线粒体膜电位崩溃，氧化磷酸化脱耦联，ATP生成障碍。而一些凋亡因子例如Cyt C释放后，激活caspase相关的凋亡蛋白。
Cyt C是线粒体呼吸链中复合体Ⅲ、 Ⅳ的重要组成部分，为一种细胞核核基因编码的水溶性蛋白质，对细胞的能量代谢有着十分重要的作用，其位于线粒体内膜的外侧，分子量在12 kDa左右，可以传导和放大凋亡型号，是心肌细胞凋亡的重要调控因子[13]。近年来对Cyt C的研究已经从控制细胞的代谢过程发展到了探讨其对细胞凋亡的影响。在凋亡过程中线粒体不仅丧失氧化产能的功能，更加重要的是由线粒体mPTP调控和释放Cyt C控制的细胞凋亡过程被激活[14]。Cyt C可以在ATP/dATP存在的条件下与蛋白酶活化因子进行结合而形成多聚体结构，进一步活化caspase-9，而caspase-9作为凋亡的启动者，释放之后收到信号便开始通过自剪和接合的方式激活，但是caspase-9并不能降解细胞本身的蛋白质，而是通过caspase级联反应来进一步活化下游不具有自我激活的能力的casepase-3，引起一系列连锁反应[15]。caspase-3活化之后作为凋亡的执行者，直接作用于损伤的心肌细胞，破坏细胞内多种重要结构和功能蛋白，使其进一步降解为凋亡小体，引起心肌细胞凋亡[16]。因此将线粒体mPTP的开放程度降低或抑制mPTP的病理性开放可以有效地保护心肌细胞，避免心肌细胞的凋亡，进一步保护心脏功能的正常行使。
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5 线粒体mPTP调控作用的两种可能机制
5.1 VDAC假说 有些研究认为VDAC是一种位于细胞线粒体外膜保守的孔道蛋白，可以在线粒体膜上形成亲水性的电压依赖通道，是线粒体与细胞质之间的主要物质交换通道，将内膜和外膜一分为二，是调控心肌细胞凋亡的重要节点[17]。VDAC对线粒体内外的物质运输有着重要的作用，VDAC蛋白结构的动态变化是VDAC关闭和开放的重要原因，因此在mPTP的开闭中也承担着重要角色。其中VDAC就控制着Cl-的跨线粒体膜的运输，Cl-是细胞中具有非常重要的生理意义的阴离子，其浓度的异常变化会影响细胞的内环境的pH，而pH又可以影响到膜信号的转导、Ca2+的稳态、兴奋—收缩耦联机制、生长代谢等一系列生理过程[18]。通过削弱“氯增加诱发钙小体释放机制”的触发作用，可以有效地减轻氧化应激反应，钙超载，维持线粒体膜电位的相对稳定，抑制Cyt C的病理性释放和caspase系列凋亡蛋白的激活，最后减少心肌细胞的凋亡[19]。文献[20]显示，4，4’-二异硫氰基芪-2，2’-二磺酸(4，4’-diisothiocyanostilbene-2，2’-disulfonicacid，DIDS)可以取消线粒体膜电位的震荡，也可以特异性的阻断VDAC，关闭线粒体mPTP。当除去细胞外的Cl-或者是加入Cl-阻断剂DIDS后可以减轻心肌细胞的损伤程度并减少心肌细胞的凋亡，VDAC还可以通过闭合mPTP来阻断ADP进入线粒体内，间接阻断ATP的合成和流动，因此还可以影响细胞能量的产生[21]。线粒体通透性的改变需要内膜和外膜的同时改变，外膜上的某些特定区域可以作為它们相互作用的接触位点，可以与胞内多种蛋白结合，而VDAC就是细胞质与外膜进行结合的位点。VDAC1是VDAC的三种亚型之一，控制物质运输，与Bcl-2家族蛋白互相作用之后可以改变线粒体外膜的通透性，导致Cyt C的释放及其他相关的凋亡因子进入胞浆，引起心肌细胞的凋亡[22]。用RNAi特异性的沉默VDAC1之后，心肌细胞的氧化应激反应减弱，钙离子超载程度减轻，保护了线粒体的膜电位，线粒体mPTP的开放程度有一定的削弱，线粒体中Cyt C的释放被抑制及活化的caspase-9，caspase-3等系列凋亡蛋白含量显著减少[23]。正常的情况下Cyt C是无法通过线粒体外膜的，Cyt C的释放受到VDAC与Bcl-2之间反应的影响，一些位于细胞内的促凋亡因子如Bax以及Bak等与VDAC结合后，增强了VDAC的活跃程度，促进了线粒体mPTP的开放。VDAC的高表达使其由单体形式向低聚体的形式转变，形成了巨大的孔道，这使得内膜区的凋亡因子得以释放，如Cyt C释放[24]。VDAC的高表达还增加了ROS的生成量，加重了氧化应激反应程度，使细胞的凋亡程度加重。而一些抗凋亡因子例如Bcl-2以及Bcl-xl位于线粒体的外膜上，可以和VDAC直接接触并结合发生反应而使得VDAC得以关闭，进而抑制Cyt C的释放[25]。, http://www.100md.com(韩学超 徐森 徐菁蔓)