董 飞， 孙红丽， 牛 楠， 李 卉， 赵 瑞， 王 婵， 赵 巍，2

    (1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学医学科学技术研究中心，银川 750004)

    急性肾损伤是以肾小球滤过功能下降为特征的常见临床综合征，产生的原因很多，如急性氧化应激、细胞缺血缺氧、毒素成分暴露、炎症及急性败血症等[1]，均可直接导致急性肾损伤，且患者发病率和死亡率相对较高。其中，缺血缺氧是导致急性肾损伤的主要原因之一[2]，并且在临床报道中日益增多。研究结果显示，短暂、急剧的急性缺氧代谢反应，会直接造成人的肾小管细胞上皮实质细胞大量凋亡的情况发生，可能导致人的肾小管实质上皮细胞数量减少，最终影响人的肾功能[3]。核呼吸诱导因子-1(nuclearrespiratoryfactor-1，NRF-1)在细胞表达功能调控中具有重要调控作用。此外，NRF-1 还可能具有更广泛的氧化作用，如在抑制血红素酶和生物碱的合成、细胞功能凋亡、氧化应激以及细胞代谢等诸多方面都可能具有一定的氧化参与抑制作用[4-5]，但目前关于NRF-1 与细胞缺氧所致的急性肾细胞功能凋亡的一些相关医学研究还尚未见明确报道。随着我国分子生物学相关技术的发展，CRISPR/Cas9 基因编辑相关技术已广泛遍布至全球各医学实验室，因其自身具有技术设计灵活、简易、可同时一次进行多少个靶点的基因编辑等优点，被广泛应用于分子生物、医学、农业等多个研究领域[6-8]。本课题研究项目拟通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术分析构建NRF-1 基因敲除的大鼠肾组织细胞，观察缺氧所致的凋亡反应发生时，NRF-1 对大鼠肾组织细胞基因凋亡功能水平的直接影响，初步分析探讨上述两者之间的相互关系，为大鼠肾损伤的基因治疗研究提供一个可能的研究方向。

    1 材料与方法

    1.1 主要细胞及试剂

    HEK-293FT 细胞由本中心实验室管理保存，大鼠肾细胞NRK-52E 购自上海中国科学院生物细胞生物库。lenti-crispr 中的载体购于Addgene(#49535)，载体结构图谱如图1 所示；T7核酸内切酶1(T7E1)、BsmBI 酶、T4 连接酶(NEB 公司)；DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；AnnexinV/FITC 凋亡检测试剂盒(BD 公司)；BCA 蛋白检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；Bax、Bcl-2、caspas-3、Cleaved-caspase-3、HIF-1a 单克隆抗体和β-actin-HRP 单克隆抗体(abcam 公司)；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP(北京中杉金桥生物技术有限公司) ......