王 燕， 杨建成， 金毅然， 马晓娜， 李家辉， 郭松林， 刘佳鑫， 梁雪云

    (1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室，银川 750004)

    缺血性脑卒中的致死率和致残率极高[1]，患者因脑缺血造成不可逆的功能神经元丧失和神经受损[2]，目前临床上仍缺乏有效的治愈方法。神经干细胞主要存在于大脑海马区，可自我更新并增殖分化为神经细胞[3]。海马区神经干细胞的增殖分化能力被脑缺血影响[4]，移植的神经干细胞可替代丢失的神经元和重建脑缺血后受损的神经回路[5]。因此，脑缺血后及时保护海马区神经干细胞有利于促进神经功能的修复[6]。干细胞移植成为最有希望治疗脑卒中的方法之一[7]。间充质干细胞可诱导分化成衍生神经干细胞样细胞[8]，但是目前相关研究较少。本课题组前期采用不同诱导培养基均可将人胎盘间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells，hPMSCs)诱导成神经细胞，且诱导的细胞具有神经干细胞的特性[9]。因此，本文旨在探究用hPMSCs 诱导成神经干细胞(hPMSCs induced neural stem cells，hPMSCsiNSCs)的条件培养基对经氧-糖剥夺(oxygen and glucose deprivation，OGD)损伤后的小鼠海马神经干细胞的治疗效果。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料与试剂

    P3 至P6 代hPMSCs 由宁夏医科大学总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室提供，细胞的采集及获取均获得宁夏医科大学总医院伦理委员会批准(伦理号：2020-289)。SPF 级雄性ICR小鼠，3 周龄，平均体质量18～20 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，所有的实验动物均符合动物伦理委员会的要求(伦理号：2020-725)，所有的实验过程均按照宁夏医科大学实验动物相关伦理规定操作。Ultraculture Serum Free Medium购自瑞士Lonza 公司；Pall Ultroser G Serum substitute 购自美国Pall 公司；Neurobasal A Medium、B27 Supplement、N2 Supplement、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco 公司；bFGF、EGF 购自美国PeproTech 公司；EdU 检测试剂盒、ROS 活性氧检测试剂盒购自苏州宇恒生物科技有限公司；层粘连蛋白包被液购自瑞典BioLamina 公司；兔抗NF、NSE、GAP43、Cleaved-Caspase-3、SOD 抗体均购自英国Abcam 公司；兔抗Nestin 抗体购自美国Invitrogen 公司；鼠抗β-actin 抗体购自美国Proteintech 公司；Cy3 标记的山羊抗兔IgG 购自美国Jackson Immuno Research 公司；IRDye 680RD 山羊抗兔IgG、IRDye 800CW 山羊抗小鼠IgG 购自美国LI-COR 公司；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司；BCA 蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；封闭羊血清、DAPI 购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物、CO2恒温培养箱、PRIMO 台式高速离心机购自美国Thermo Fisher 公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；Odyssey CLx 双色红外激光成像仪购自美国LI-COR 公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；6 孔板、12 孔板、培养皿及离心管等耗材均购自美国康宁公司 ......