张志蕊， 陈耀平

    (1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院，银川 750004)

    迟发性性腺功能减退症(late-onset hypogonadism，LOH)是一种与老龄相关的临床和生化综合征，其特点是一系列特异的临床症状和血清T水平缺乏(低于年轻的健康成年男性参考范围)[1，2]。由于睾酮的作用广泛涉及生殖、皮肤、泌尿肌肉、骨骼、心血管等存在雄激素受体的系统，LOH 的发生会导致患者生活质量的改变，且使多器官系统的功能受到影响[3]。研究发现，循环miRNA 可以非常准确地作为衰老[4]、癌症[5-7]、肌肉疾病[8-9]和神经退行性疾病有前途的生物标记物[10]。课题组前期研究[11]发现，miR-133a-3p 在LOH 患者低表达，并且miR-133a 作为肌肉特异性的miRNA，能促进肌肉的成熟，降低肌肉蛋白质分解的速度而促进肢体骨骼肌的健康[12-13]。本研究通过构建过表达及干扰慢病毒载体并筛选建立miR-133a-3p 稳转细胞株，为进一步研究miR-133a-3p与LOH 的相关机制以及LOH 的诊断和治疗奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    SPF 级2 月龄SD 雄性大鼠3 只，体质量190～220 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供；大肠杆菌菌株DH5α，慢病毒载体GV309、GV280及Polybrene 均购自上海吉凯基因科技有限公司；DMEM 细胞培养液、标准胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco 公司；Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和TB GreenqRTPCR、DNase I、TB Green Advantage qPCR Premix均购自日本TaKaRa 公司，Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司，限 制 性 内 切 酶AgeⅠ、NheⅠ及EcoRⅠ均购自美国NEB 公司；质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen 公司，miR-133a-3p 引物合成由广州锐博生物科技有限公司完成，质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司完成；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)购自Abcam 公司。

    1.2 大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum muscle cell，CCSMC)的原代培养及鉴定

    采用改良组织块法原代培养大鼠CCSMCs[14]，选取2 月龄雄性SD 大鼠，颈椎脱臼或异戊巴比妥钠注射处死大鼠 ......