李家瑞， 徐 彧， 徐海瑾， 李建宁， 李 岩， 宋 辉， 杨 怡

    (1.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，银川 750004； 2.宁夏医科大学内分泌学研究所，银川 750004；3.宁夏医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学系，银川 750004)

    大鼠是第一种用于科学研究的哺乳动物，因其生理调节能力和药理反应等方面与人类相似[1]，常作为动物模型广泛地应用于生理、药理与毒理研究。但大鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的建立直到2008 年才得以成功[2]。ESCs 能够分化为机体所有类型细胞[3]，为研究再生医学[4-5]和发育生物学提供了丰富的细胞来源。ESCs 的体外分化通常需要先形成类胚体(embryoid bodies，EBs)[5]，EBs 是三维的细胞聚集体，含有3 个胚层的所有细胞类型[6]。体外形成的EBs通过定向诱导分化的方法，可以获得个体发育早期体内的一些前体细胞群[7]，如心肌细胞[8-9]、神经细胞[10]、血细胞[11]、胰腺细胞[12]等。课题组前期研究发现，使用小鼠EBs 的诱导方法将大鼠ESCs 诱导分化为EBs 的过程中细胞死亡率极高，获得EBs 的数量也无法满足后续实验的需要。因此，有效地生产大鼠EBs，是使用大鼠ESCs 定向分化成所需细胞类型进行相关科学研究的关键。本研究通过悬滴法和悬浮法[13]将大鼠ESCs 制备为EBs 并连续培养10 d，在第5 天和第10 天对其进行形态学观察、直径测量、数量统计以及特异性基因与蛋白表达的检测，对两种方法得到的EBs 进行比较，了解两种方法的优劣，筛选在不同情况下更适宜的EBs 制备方法，为通过EBs 途径体外分化特定类型细胞用于临床疾病的研究提供参考。

    1 材料与方法

    1.1 主要仪器

    荧光定量PCR 仪、酶标仪、电泳仪(美国Bio-Rad 公司)；核酸超微量仪(德国GE 公司)；化学发光成像仪(美国Azure 公司)；倒置荧光显微镜(德国Leica 公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo Pisher Scientific 公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司) ......