王 佳， 马丽媛， 母春兰， 刘春莲， 焦海燕

    (1.宁夏医科大学教育部生育力保持重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学系，银川 750004； 3. 宁夏医科大学总医院生殖中心，银川 750004)

    近年来，不育已成为世界范围内的重要健康问题之一。近50%的不育与男性因素有关[1]，而活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的睾丸组织损伤是其主要原因[2]。睾丸组织细胞质膜中丰富的多不饱和脂肪酸易受ROS 攻击[3-4]。当机体内过量的ROS 打破氧化-抗氧化平衡时，则会发生氧化应激(oxidative stress，OS)。目前研究[5]发现，由ROS 导致的脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)积累是引发铁死亡的关键因素。铁死亡是一种铁依赖的LPO 积累引起的调节性细胞死亡。不同于其他的细胞死亡形式，当发生铁死亡时，细胞内Fe2+浓度升高，LPO 水平增加，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低[6]，线粒体萎缩，膜密度增大，嵴减少或消失[7]。有研究[8-9]显示，男性不育患者精子中ROS 积累、GPX4 活性降低，推测OS 导致的生殖损伤与铁死亡有关，但目前尚缺乏直接证据，且缺乏用于相关研究的细胞模型。因H2O2极易透过细胞膜，可与细胞内的Fe2+通过Fenton 反应使细胞产生大量ROS 和丙二醛(malondialdehyde，MDA)[10]，常被用于诱导细胞产生OS。本研究拟用H2O2诱导小鼠睾丸间质TM3 细胞建立铁死亡细胞模型，研究结果将为进一步研究铁死亡对生殖细胞的影响及抗氧化药物对雄性生殖细胞的保护作用及机制奠定实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    小鼠睾丸间质TM3 细胞购于中国科学院上海细胞库(北纳公司代理)；全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、MDA 试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒与ROS检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；LPO 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DMSO 购自美国Sigma 公司；50%H2O2购自四川金山制药有限公司；青链霉素购自Solarbio 公司；FBS 胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司；DMEM 培养基购自Hyclone 公司；无水乙醇购自生工生物工程(上海)股份有限公司；GSH 过氧化物酶4 抑制剂(RSL3)与铁死亡蛋白抑制剂(iFSP1)购自MCE 公司；Phen-Green-SK(25393)荧光探针购自Cayman 公司；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司 ......