徐 彧， 徐海瑾， 李家瑞， 孔 斌， 李 卉， 陆 宏， 宋 辉

    (1. 宁夏医科大学基础医学院医学遗传学与细胞生物学系，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，银川 750004； 3. 宁夏医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，银川 750004)

    间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞[1]，源于机体发育不同阶段的多个组织和器官中，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙髓等[2]。基于低免疫原性、组织来源多样化、易于在体外分离并快速扩增等优势[2-4]，MSCs 的研究和治疗取得了一定进展。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是较早发现并研究较为深入的一种MSCs[5]。研究[6]表明，MSCs 主要通过其所衍生的外泌体来发挥旁分泌修复作用。外泌体粒径为30～150 nm，普遍存在于各种体液中，并携带亲代细胞中的蛋白质、脂质、DNA、RNA 等重要物质[7-8]，可以进行细胞间信息传递，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生发展密切相关[9]。研究[10]发现，MSCs 外泌体不仅具有与亲代MSCs 相似的生物学作用，且免疫原性更低，更容易量化，并能在储存和运输过程中保持生物活性，克服了MSCs 的很多缺陷，有望替代MSCs 成为新型的无细胞疗法。如何有效地制备外泌体，并保留其生物学特性，是进一步实验研究及临床应用的重要前提。目前，提取外泌体的主要方法有超速差速离心法、ExoQuick-TCTM法、密度梯度离心法、色谱法等[11-13]，但均未形成规范化体系。本研究对大鼠BMMSCs 外泌体两种提取方法(超速差速离心法与ExoQuick-TCTM法)进行比较，以期筛选适合大鼠BMMSCs 外泌体的有效提取方法。

    1 材料与方法

    1.1 主要仪器及试剂

    超高速离心管、超速高速离心机(Thermo MTX150)购于赛默飞世尔科技有限公司；透射电子显微镜(HITACHI H-7650)购于日本日立公司；DMEM/F12 培养基(10565-018)购于美国Gibco 公司；无外泌体血清(C3801-0100)购于德国BI 公司；RIPA 裂解液(P0013B)购于上海碧云天生物技术有限公司；油红O 及茜素红均购于赛业(广州)生物科技有限公司；胎牛血清购于美国Gibco 公司；CD63(PA5-92370)购自美国Invitrogen 公司；CD81(ab109201)购自英国Abcam 公司；β-actin(AP0060)购自Bioworld 公司；Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)(ab6721)购自英国Abcam公司；ExoQuick-TCTMExosome Precipitation Solution购于System Biosciences 公司 ......