利用基因芯片分析慢性乙肝患者树突细胞基因表达差异
【摘要】目的为了探讨HBV-DC在基因表达上与非感染者基因表达的差异。方法IL-4、GM-CSF将单核细胞诱导为树突细胞，LPS刺激成熟，利用基因芯片分析mRNA表达。结果HBV-DC与免疫有关的基因表达下降。结论HBV等抗原加工、提呈等有关的基因表达下调。
【关键词】基因芯片；慢性乙肝；树突细胞；基因表达
HBV慢性感染认为机体及病毒本身等多种因素有关，近年来研究表明，HBV感染者机体树突细胞(dendritic cells,DC)存在功能障碍，表现为作为其成熟标志的CD83分子表达下调，在混合淋巴细胞反应中协同刺激能力下降，而DC是机体最为强大的抗原提呈细胞，其功能障碍可能导致机体不能产生抗原特异性的体液及细胞免疫反应，是HBV感染慢性的原因之一，笔者利用基因芯片技术，比较了HBV-DC与正常DC，发现HBV-DC存在免疫下调趋势，尤其是可抗原加工提呈过程中的有关基因表达下调。
1资料与方法
, 百拇医药
1.1一般资料10例慢性乙肝病例来自笔者所在医院住院患者，符合《2005慢性乙肝治疗指南》诊断标准，10例对照来源于健康志愿者。
1.2试剂IL-4，(rh)GM-CSF购自R＆D SYSTEMSLPS购自Sigma。
1.3树突细胞的培养方法(1)每例无菌采血20 ml，肝素抗凝。(2)将静脉血沿试管壁缓慢加入含2倍体积淋巴细胞分离液试管。(3)1500～2000 r/mim离心30 min。(4)用巴氏管吸取淋巴细胞层细胞，PBS洗涤2次。(5)将细胞在1640培养液中重新悬浮，接种于6孔培养板(每含细胞1×107)，在37 ℃，5%CO2，饱和湿度下培养3 h，吸去悬浮细胞，重新加入含10%胎牛血清，谷氨酰胺每2 mmol/L，GM-CSF 100 ng/ml，IL-4 100 ng/ml，培养液4 ml，隔日半量换液，保持细胞因子浓度不变，培养7 d加入LPS，终浓度100 ng/ml，24 h后收集细胞，加入固定液，-70 ℃保存。
, 百拇医药
1.4基因芯片分析将每组标本随机分为2组，每组5例，混合后，由深圳微芯公司进行基因芯片分析，其结果出平均值，其操作步骤包括提取RNA标本，并进行质量质检，确认标本合格。使用微芯公司基因表达芯片CSC-GE-80于双荧光标记样本进行芯片扫描，图像分析等一系列处理。
2结果
2.1培养第2天吸附细胞开始脱落，第5天细胞成簇分布，可见许多突起细胞，并逐渐增多，经LPS刺激24 h后，多数细胞具有典型的DC形态分布，不易分散，胞体不规则，有细长突起。
2.2基因分析笔者所在医院根据试验组对照组信号强度比值>2或<0.5的数据点为显著性表达变化的基因点，共有2451个有效数据，其中356个基因存在显著表达差异，试验组有143个基因上调，213个基因下调，从总体数据分析，更多表现为下调变化，其中大部分免疫相关基因呈下调趋势，如CD83 -2.99，DC-CK1 -12.99，GILT -2.99，Diubiquitin -5.10等。
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3讨论
抗原提呈细胞具有抗原识别、加工、迁移至次级淋巴组织，以及细胞表面表达协同刺激分子等能力。在次级淋巴组织的T细胞区，抗原提呈细胞比如成熟DC将抗原提呈给初始T淋巴细胞是起动免疫反应的第一步，成熟DC与初始T淋巴细胞通过MHC分子，协同刺激分子，T细胞受体形成紧密接触是起动有效免疫反应所必须的[1]。CD83作为一种协同刺激分子，其功能不十分明确，在DC成熟后起表达明显上升，认为与抗原提呈功能有关。有研究表明，将SiRNA抑制单核细胞分化而来的树突细胞CD83 mRNA的表达，能显著抑制其T细胞刺激能力[2]。笔者所在医院通过基因芯片研究发现HBV-DC表面CD83下调，与混合淋巴细胞反应中功能减退一致，笔者推测其CD83 mRNA下调是其表面CD83分子减少的原因之一。
天然蛋白分子在抗原提呈细胞中需要加工成短肽，才能与MHCⅡ结合，有利于T细胞受体识别。二硫键的还原是抗原加工的关键步骤，笔者发现HBV-DC中的γ干扰素诱导溶酶体巯基还原酶(IFNγ-inducible lysosomal thiol reductase，GILT)表达下降。GILT在抗原提呈细胞中持续表达，GILT与MHCⅡ分子在细胞内分布在同一区域，在酸性环境中具有强大的还原作用，已有研究证明与MHCⅡ限制的抗原加工、提呈有关[3]。HBV-DC表达下调，可能与HBV感染者不能产生有效地体液免疫反应，导致感染慢性化有关。
, http://www.100md.com
MHCⅠ类分子提呈多肽抗原主要来源于26S蛋白酶体对泛素(ubiquitin)标记的靶蛋白降解产物，笔者发现一种与泛素相关的Diubiquitin基因表达下调。Diubiquitin具有两个泛素样功能区，N端功能区于泛素同源性为29%，C端为36%。C端与泛素一样含有与底物蛋白的络合所必需的2个甘氨酸残基，两个功能区内含有于多聚泛素键形成有关的赖氨酸残基。Diubiquitin功能至今不明，但根据其于泛素具有相似结构，基因编码定位于HLA-F位点，该区域编码许多与免疫反应有关的基因，及主要由成熟B细胞及DC分泌物，TNFα、IFNγ对其表达具有协同调节作用，均提示于MHCⅠ类分子提呈有关[4]。HBV-DC Diubiquitin表达下降与HBV急性感染者不能产生有效地特异性的细胞免疫有一点关系。
笔者同时发现一种由成熟DC分泌的CC趋化因子DC-CK1(dendritic cell derived cc chemokine-1)表达明显下调，因其受体不明，功能不十分清楚。DC-CK1对CD45 RA+的初始T细胞，CD38-的初始B细胞具有趋化作用，在淋巴结生发中心，T细胞区均可检测到由DC表达的DC-CK1。B、T初次应答分别在这些区域发生，提示DC-CK1与初次免疫应答有关。另外目前认为，B细胞激活需要DC、T、B细胞形成细胞复合体，只有DC-CK1有助于DC/B细胞交联，体外实验证明这种交联对B细胞初次活化起重要作用，HBV-DC下调表达DC-CK1可能会造成初次免疫应答下降。
, 百拇医药
综上所述，笔者发现HBV-DC免疫有关的分子呈受抑制状态，尤其与抗原加工提呈过程有关基因表达下调，医护人员为进一步研究HBV-DC功能缺陷提供了新的线索，但mRNA水平并不能真正代表蛋白质水平，上述基因在HBV-DC中的作用需要进一步深入探讨。
参考文献
[1]Alexander T,Prechtel,Nadine M,et al.CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.J Immunology,2007,178:5454-5464.
[2]Hastinqs KT,Lackman RL,Cresswll P.Functional Requirements for the lysosomal thiol reductase GILT in MHC class Ⅱ-restricted antigen processing.J Immunology,2006,177(12):8569-77.
, http://www.100md.com
[3]Raasi S,Schmidtke G,de GialiR,et al.A ubiqutin-like protein which is synergisitically inducible by interfon-gamma and tumor necrosis factor-alpha.Eur J Immunology,1999,29(12):4030-4036.
[4]Lindhout E,Vissers JL,Hartqers FC,et al.The dendritic cell-specific CC-chemokine DC-CK1 is expressed by germinal center dendritic cells and attracts CD38-negative mantle zone B lymphocytes.J lmmunol,2001,166(5):3284-3289.
【收稿日期】2011-04-27
(本文编辑：郎威), http://www.100md.com(范勇 谭德明)
【关键词】基因芯片；慢性乙肝；树突细胞；基因表达
HBV慢性感染认为机体及病毒本身等多种因素有关，近年来研究表明，HBV感染者机体树突细胞(dendritic cells,DC)存在功能障碍，表现为作为其成熟标志的CD83分子表达下调，在混合淋巴细胞反应中协同刺激能力下降，而DC是机体最为强大的抗原提呈细胞，其功能障碍可能导致机体不能产生抗原特异性的体液及细胞免疫反应，是HBV感染慢性的原因之一，笔者利用基因芯片技术，比较了HBV-DC与正常DC，发现HBV-DC存在免疫下调趋势，尤其是可抗原加工提呈过程中的有关基因表达下调。
1资料与方法
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1.1一般资料10例慢性乙肝病例来自笔者所在医院住院患者，符合《2005慢性乙肝治疗指南》诊断标准，10例对照来源于健康志愿者。
1.2试剂IL-4，(rh)GM-CSF购自R＆D SYSTEMSLPS购自Sigma。
1.3树突细胞的培养方法(1)每例无菌采血20 ml，肝素抗凝。(2)将静脉血沿试管壁缓慢加入含2倍体积淋巴细胞分离液试管。(3)1500～2000 r/mim离心30 min。(4)用巴氏管吸取淋巴细胞层细胞，PBS洗涤2次。(5)将细胞在1640培养液中重新悬浮，接种于6孔培养板(每含细胞1×107)，在37 ℃，5%CO2，饱和湿度下培养3 h，吸去悬浮细胞，重新加入含10%胎牛血清，谷氨酰胺每2 mmol/L，GM-CSF 100 ng/ml，IL-4 100 ng/ml，培养液4 ml，隔日半量换液，保持细胞因子浓度不变，培养7 d加入LPS，终浓度100 ng/ml，24 h后收集细胞，加入固定液，-70 ℃保存。
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1.4基因芯片分析将每组标本随机分为2组，每组5例，混合后，由深圳微芯公司进行基因芯片分析，其结果出平均值，其操作步骤包括提取RNA标本，并进行质量质检，确认标本合格。使用微芯公司基因表达芯片CSC-GE-80于双荧光标记样本进行芯片扫描，图像分析等一系列处理。
2结果
2.1培养第2天吸附细胞开始脱落，第5天细胞成簇分布，可见许多突起细胞，并逐渐增多，经LPS刺激24 h后，多数细胞具有典型的DC形态分布，不易分散，胞体不规则，有细长突起。
2.2基因分析笔者所在医院根据试验组对照组信号强度比值>2或<0.5的数据点为显著性表达变化的基因点，共有2451个有效数据，其中356个基因存在显著表达差异，试验组有143个基因上调，213个基因下调，从总体数据分析，更多表现为下调变化，其中大部分免疫相关基因呈下调趋势，如CD83 -2.99，DC-CK1 -12.99，GILT -2.99，Diubiquitin -5.10等。
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3讨论
抗原提呈细胞具有抗原识别、加工、迁移至次级淋巴组织，以及细胞表面表达协同刺激分子等能力。在次级淋巴组织的T细胞区，抗原提呈细胞比如成熟DC将抗原提呈给初始T淋巴细胞是起动免疫反应的第一步，成熟DC与初始T淋巴细胞通过MHC分子，协同刺激分子，T细胞受体形成紧密接触是起动有效免疫反应所必须的[1]。CD83作为一种协同刺激分子，其功能不十分明确，在DC成熟后起表达明显上升，认为与抗原提呈功能有关。有研究表明，将SiRNA抑制单核细胞分化而来的树突细胞CD83 mRNA的表达，能显著抑制其T细胞刺激能力[2]。笔者所在医院通过基因芯片研究发现HBV-DC表面CD83下调，与混合淋巴细胞反应中功能减退一致，笔者推测其CD83 mRNA下调是其表面CD83分子减少的原因之一。
天然蛋白分子在抗原提呈细胞中需要加工成短肽，才能与MHCⅡ结合，有利于T细胞受体识别。二硫键的还原是抗原加工的关键步骤，笔者发现HBV-DC中的γ干扰素诱导溶酶体巯基还原酶(IFNγ-inducible lysosomal thiol reductase，GILT)表达下降。GILT在抗原提呈细胞中持续表达，GILT与MHCⅡ分子在细胞内分布在同一区域，在酸性环境中具有强大的还原作用，已有研究证明与MHCⅡ限制的抗原加工、提呈有关[3]。HBV-DC表达下调，可能与HBV感染者不能产生有效地体液免疫反应，导致感染慢性化有关。
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MHCⅠ类分子提呈多肽抗原主要来源于26S蛋白酶体对泛素(ubiquitin)标记的靶蛋白降解产物，笔者发现一种与泛素相关的Diubiquitin基因表达下调。Diubiquitin具有两个泛素样功能区，N端功能区于泛素同源性为29%，C端为36%。C端与泛素一样含有与底物蛋白的络合所必需的2个甘氨酸残基，两个功能区内含有于多聚泛素键形成有关的赖氨酸残基。Diubiquitin功能至今不明，但根据其于泛素具有相似结构，基因编码定位于HLA-F位点，该区域编码许多与免疫反应有关的基因，及主要由成熟B细胞及DC分泌物，TNFα、IFNγ对其表达具有协同调节作用，均提示于MHCⅠ类分子提呈有关[4]。HBV-DC Diubiquitin表达下降与HBV急性感染者不能产生有效地特异性的细胞免疫有一点关系。
笔者同时发现一种由成熟DC分泌的CC趋化因子DC-CK1(dendritic cell derived cc chemokine-1)表达明显下调，因其受体不明，功能不十分清楚。DC-CK1对CD45 RA+的初始T细胞，CD38-的初始B细胞具有趋化作用，在淋巴结生发中心，T细胞区均可检测到由DC表达的DC-CK1。B、T初次应答分别在这些区域发生，提示DC-CK1与初次免疫应答有关。另外目前认为，B细胞激活需要DC、T、B细胞形成细胞复合体，只有DC-CK1有助于DC/B细胞交联，体外实验证明这种交联对B细胞初次活化起重要作用，HBV-DC下调表达DC-CK1可能会造成初次免疫应答下降。
, 百拇医药
综上所述，笔者发现HBV-DC免疫有关的分子呈受抑制状态，尤其与抗原加工提呈过程有关基因表达下调，医护人员为进一步研究HBV-DC功能缺陷提供了新的线索，但mRNA水平并不能真正代表蛋白质水平，上述基因在HBV-DC中的作用需要进一步深入探讨。
参考文献
[1]Alexander T,Prechtel,Nadine M,et al.CD83 knockdown in monocyte-derived dendritic cells by small interfering RNA leads to a diminished T cell stimulation.J Immunology,2007,178:5454-5464.
[2]Hastinqs KT,Lackman RL,Cresswll P.Functional Requirements for the lysosomal thiol reductase GILT in MHC class Ⅱ-restricted antigen processing.J Immunology,2006,177(12):8569-77.
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[3]Raasi S,Schmidtke G,de GialiR,et al.A ubiqutin-like protein which is synergisitically inducible by interfon-gamma and tumor necrosis factor-alpha.Eur J Immunology,1999,29(12):4030-4036.
[4]Lindhout E,Vissers JL,Hartqers FC,et al.The dendritic cell-specific CC-chemokine DC-CK1 is expressed by germinal center dendritic cells and attracts CD38-negative mantle zone B lymphocytes.J lmmunol,2001,166(5):3284-3289.
【收稿日期】2011-04-27
(本文编辑：郎威), http://www.100md.com(范勇 谭德明)
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