地中海贫血实验诊断的研究进展(2)
2基因诊断法
地中海贫血的发病和珠蛋白合成受阻断有关，该并大多数患者均是由于珠蛋白合成缺失而导致。随着现代医疗水平的高速进步，人类遗传病的治疗和诊断得到了极大发展。地中海贫血症的发生目前除被认为与DNA构造相关外，还被认为与基因转录、翻译过程密切关联[12]，所以应用以DNA为水平的基因检测可以更好的预防和诊断地中海贫血症。基因诊断中的探测物为患者某一特定基因，探测内容至少应包括DNA与mRNA[13]。目前，地中海贫血症的基因诊断已经被应用于临床，也将逐步发展成为一项实用的应用技术。本研究将应用于我国地中海贫血症实验室诊断的基因诊断法总结如下。
2.1聚合酶链反应(PCR)通过筛查法中的血红蛋白电泳检测可进行地中海贫血症的初步诊断，但仍存在某些地中海贫血不能达到有效诊断的问题。PCR利用DNA的聚合酶经体外作用于成对引物，催化两者间特异的DNA片段，促使基因合成，实现体外扩增技术。应用PCR为诊断方法具有操作简便、准确率高、检测速度快，适合临床广泛应用。针对两对以上特异性等位基因对的引物，还可应用多重PCR诊断。多重PCR诊断根据每组基因对突变位点的特异性扩增确定诊断结果，适合于因各种基因缺失而引发的地中海贫血。
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2.2PCR结合斑点杂交法PCR结合斑点杂交法首次被应用于β-地中海贫血症的诊断和分型，结果证明该法结果可靠、准确性高，且检测时所耗样品量少、经济方便。但以该法行地中海贫血的实验室诊断时，应注意逐一仔细筛查待测基因，直至确诊某种突变，所以使用该法耗时长，且必须具备以下条件：(1)以已知突变基因为模版，应用PCR法分别扩展合成正常序列和突变序列的基因片段，将突变基因置于中心位置，并标记为探针；(2)挑选适合引物；(3)严格掌控杂交条件，保证探针和待测碱基间无配错情况，避免杂交失败。
2.3DNA点杂交检测法以DNA为靶分子进行DNA和DNA之间的杂交。杂交后以电泳法分离待测基因片段，将其转印并与某固相支持物结合，最后应用已标记的DNA探针检测。该法是最早应用于地中海贫血的实验室诊断方法，但诊断效率较低。20世纪80年代末期，有学者提出了反向杂交技术法诊断地中海贫血症。应用反向杂交法可明显提高诊断效率。经改良后的反向点杂交技术能针对多种类型的地中海贫血中的已知突变探针对，运用末端转移酶使其形成多聚尾巴，最后固定于指定膜上进行靶序列的扩增杂交。反向杂交技术的应用可以在一次杂交的基础上获得待测样本中多种突变序列的筛查结果，大大缩短了检测时间，提高了诊断效率。反向杂交技术经二次杂交后还能正确判断地中海贫血的类型，确定突变类型不同的纯合子、杂合子和等位基因对等，是见年来我国应用较多的地中海贫血实验室诊断方法。
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2.4寡核苷酸探针(ASO)检测法等位基因特异性ASO探针检测技术为突变类型已知的地中海贫血实验室诊断法中最具代表性的方法之一。ASO探针技术能快速直接地找到患者所缺失的基因序列，准确判定地中海贫血的类型，具有高灵敏度、简单易行、特异性高等优点。但该法检测时仅针对某种或某类基因突变，需多次重复探测才能对待测样品进行准确评估。我国已有学者将ASO探针法应用于中国地中海贫血患者的实验室诊断，结果表明该法能够诊断出18种常见的突变探针，可以成功检测中国人口的地中海贫血症。也有学者证明该法除具有高的诊断准确率外，还能对大样本进行筛查和基因定型，能为地中海贫血的产前筛查提供新的检测手段。
2.5等位基因特异性扩增技术(ARMS)该法具有特异性，是针对某种突变类型的地中海贫血症而进行的针对性检测。该法针对特定的突变类型筛选特异性的碱基引物，通过扩增后的电泳分离结果断定有无相应点的突变。该法特别适合于小片段DNA的电泳分析，可以用于痕量检测，具有结果清晰、准确可靠等优点。
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2.6限制性片段长度多态性连锁分析法(RFLP)该法是间接性的测试方法，是早期经常应用的地中海贫血实验室诊断方法。限制性片段长度多态性常表现在群体中，多是由于突变后限制性内切酶的作用位点改变或消失而导致对应DNA酶切片段发生变化。通过增加引物序列扩增产物中的酶切位点，并应用相对应的限制性内切酶水解正常和突变后的扩增产物，能应用电泳分离法而实现地中海贫血基因的检测。该法检测能反映出不同长度限制性片段中各种基因型的差异，但仍存在诊断局限性和操作繁琐性。
2.7基因芯片杂交法随着医学工作者对地中海贫血症的深入了解，基因突变类型的检测有了多种检测方法[14]。基因芯片杂交技术具有简单快速、痕量分析、自动准确、高效方便等众多优势，已成为地中海贫血基因诊断的重要新方法。基因芯片杂交法诊断地中海贫血是以核苷酸扩增为基础，应用荧光标记法或引物延伸法检测突变基因。该法以荧光的不同位点和颜色深浅变化为判断地中海贫血基因突变的类型，比传统方法具有更高的灵敏性和特异性，检测结果也更具准确性。基因芯片技术还因基因芯片具有较高的通量，能将多个地中海贫血待测基因集中于一张芯片上完成筛查，特别适合于人口中地中海贫血的大面积普查。但基因芯片造价高、成本昂贵，较难普及于临床检验。
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综上所述，将筛查法和基因诊断法有机结合后统一应用，可以为地中海贫血的实验室诊断方面做出相应的贡献。地中海贫血的实验室诊断总的标准为简单方便、快捷高效、成本便宜，能够保证提高地中海贫血实验室诊断的准确性，避免误诊和漏查现象[15～17]。随着现代社会科学技术的日益更新，地中海贫血的多种实验室诊断检测方法层出不穷。
参考文献
[1]李霞，杨林，杨承东，等.地中海贫血的筛查与产前诊断.中国优生与遗传杂志，2008,16(2)：43-78.
[2]刘元力，胡朝晖，曾征宇，等.β-地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析.中国医药导报，2008,5(5)：25-26.
[3]Hu H,Ii C,Xiong Q,et al.Prenatal diagnosis of beta-thalassemia by chip-based capillary electrophoresis.Prenat Diagn,2008,13(4)：123.
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[4]Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by multiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing countries like Pakistan.Prenat Diagn,2007,27(6)：580.
[5]Traeger-synodinos J.Real-time PCR for prenatal and preimplantation genetic diagnosis of monogenic diseases.Mol Aspects Med,2006,27(2)：176.
[6]Zeren F.Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemog 1obinopathies in Turkey.Hemoglobin,2007,3l(2)：273.
[7]何雅军，杨小华，马福广，等.红细胞平均体积和脆性及血红蛋白电泳联合检测在地中海贫血诊断中的价值.中华检验医学杂志，2005,28(3)：244., http://www.100md.com(黄莲芬)
地中海贫血的发病和珠蛋白合成受阻断有关，该并大多数患者均是由于珠蛋白合成缺失而导致。随着现代医疗水平的高速进步，人类遗传病的治疗和诊断得到了极大发展。地中海贫血症的发生目前除被认为与DNA构造相关外，还被认为与基因转录、翻译过程密切关联[12]，所以应用以DNA为水平的基因检测可以更好的预防和诊断地中海贫血症。基因诊断中的探测物为患者某一特定基因，探测内容至少应包括DNA与mRNA[13]。目前，地中海贫血症的基因诊断已经被应用于临床，也将逐步发展成为一项实用的应用技术。本研究将应用于我国地中海贫血症实验室诊断的基因诊断法总结如下。
2.1聚合酶链反应(PCR)通过筛查法中的血红蛋白电泳检测可进行地中海贫血症的初步诊断，但仍存在某些地中海贫血不能达到有效诊断的问题。PCR利用DNA的聚合酶经体外作用于成对引物，催化两者间特异的DNA片段，促使基因合成，实现体外扩增技术。应用PCR为诊断方法具有操作简便、准确率高、检测速度快，适合临床广泛应用。针对两对以上特异性等位基因对的引物，还可应用多重PCR诊断。多重PCR诊断根据每组基因对突变位点的特异性扩增确定诊断结果，适合于因各种基因缺失而引发的地中海贫血。
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2.2PCR结合斑点杂交法PCR结合斑点杂交法首次被应用于β-地中海贫血症的诊断和分型，结果证明该法结果可靠、准确性高，且检测时所耗样品量少、经济方便。但以该法行地中海贫血的实验室诊断时，应注意逐一仔细筛查待测基因，直至确诊某种突变，所以使用该法耗时长，且必须具备以下条件：(1)以已知突变基因为模版，应用PCR法分别扩展合成正常序列和突变序列的基因片段，将突变基因置于中心位置，并标记为探针；(2)挑选适合引物；(3)严格掌控杂交条件，保证探针和待测碱基间无配错情况，避免杂交失败。
2.3DNA点杂交检测法以DNA为靶分子进行DNA和DNA之间的杂交。杂交后以电泳法分离待测基因片段，将其转印并与某固相支持物结合，最后应用已标记的DNA探针检测。该法是最早应用于地中海贫血的实验室诊断方法，但诊断效率较低。20世纪80年代末期，有学者提出了反向杂交技术法诊断地中海贫血症。应用反向杂交法可明显提高诊断效率。经改良后的反向点杂交技术能针对多种类型的地中海贫血中的已知突变探针对，运用末端转移酶使其形成多聚尾巴，最后固定于指定膜上进行靶序列的扩增杂交。反向杂交技术的应用可以在一次杂交的基础上获得待测样本中多种突变序列的筛查结果，大大缩短了检测时间，提高了诊断效率。反向杂交技术经二次杂交后还能正确判断地中海贫血的类型，确定突变类型不同的纯合子、杂合子和等位基因对等，是见年来我国应用较多的地中海贫血实验室诊断方法。
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2.4寡核苷酸探针(ASO)检测法等位基因特异性ASO探针检测技术为突变类型已知的地中海贫血实验室诊断法中最具代表性的方法之一。ASO探针技术能快速直接地找到患者所缺失的基因序列，准确判定地中海贫血的类型，具有高灵敏度、简单易行、特异性高等优点。但该法检测时仅针对某种或某类基因突变，需多次重复探测才能对待测样品进行准确评估。我国已有学者将ASO探针法应用于中国地中海贫血患者的实验室诊断，结果表明该法能够诊断出18种常见的突变探针，可以成功检测中国人口的地中海贫血症。也有学者证明该法除具有高的诊断准确率外，还能对大样本进行筛查和基因定型，能为地中海贫血的产前筛查提供新的检测手段。
2.5等位基因特异性扩增技术(ARMS)该法具有特异性，是针对某种突变类型的地中海贫血症而进行的针对性检测。该法针对特定的突变类型筛选特异性的碱基引物，通过扩增后的电泳分离结果断定有无相应点的突变。该法特别适合于小片段DNA的电泳分析，可以用于痕量检测，具有结果清晰、准确可靠等优点。
, http://www.100md.com
2.6限制性片段长度多态性连锁分析法(RFLP)该法是间接性的测试方法，是早期经常应用的地中海贫血实验室诊断方法。限制性片段长度多态性常表现在群体中，多是由于突变后限制性内切酶的作用位点改变或消失而导致对应DNA酶切片段发生变化。通过增加引物序列扩增产物中的酶切位点，并应用相对应的限制性内切酶水解正常和突变后的扩增产物，能应用电泳分离法而实现地中海贫血基因的检测。该法检测能反映出不同长度限制性片段中各种基因型的差异，但仍存在诊断局限性和操作繁琐性。
2.7基因芯片杂交法随着医学工作者对地中海贫血症的深入了解，基因突变类型的检测有了多种检测方法[14]。基因芯片杂交技术具有简单快速、痕量分析、自动准确、高效方便等众多优势，已成为地中海贫血基因诊断的重要新方法。基因芯片杂交法诊断地中海贫血是以核苷酸扩增为基础，应用荧光标记法或引物延伸法检测突变基因。该法以荧光的不同位点和颜色深浅变化为判断地中海贫血基因突变的类型，比传统方法具有更高的灵敏性和特异性，检测结果也更具准确性。基因芯片技术还因基因芯片具有较高的通量，能将多个地中海贫血待测基因集中于一张芯片上完成筛查，特别适合于人口中地中海贫血的大面积普查。但基因芯片造价高、成本昂贵，较难普及于临床检验。
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综上所述，将筛查法和基因诊断法有机结合后统一应用，可以为地中海贫血的实验室诊断方面做出相应的贡献。地中海贫血的实验室诊断总的标准为简单方便、快捷高效、成本便宜，能够保证提高地中海贫血实验室诊断的准确性，避免误诊和漏查现象[15～17]。随着现代社会科学技术的日益更新，地中海贫血的多种实验室诊断检测方法层出不穷。
参考文献
[1]李霞，杨林，杨承东，等.地中海贫血的筛查与产前诊断.中国优生与遗传杂志，2008,16(2)：43-78.
[2]刘元力，胡朝晖，曾征宇，等.β-地中海贫血一个特殊基因突变的家系分析.中国医药导报，2008,5(5)：25-26.
[3]Hu H,Ii C,Xiong Q,et al.Prenatal diagnosis of beta-thalassemia by chip-based capillary electrophoresis.Prenat Diagn,2008,13(4)：123.
, 百拇医药
[4]Baig SM.Molecular diagnosis of beta-thalassemia by multiplex ARMS-PCR：a cost effective method for developing countries like Pakistan.Prenat Diagn,2007,27(6)：580.
[5]Traeger-synodinos J.Real-time PCR for prenatal and preimplantation genetic diagnosis of monogenic diseases.Mol Aspects Med,2006,27(2)：176.
[6]Zeren F.Preliminary Data on Preimplantation Genetic Diagnosis for Hemog 1obinopathies in Turkey.Hemoglobin,2007,3l(2)：273.
[7]何雅军，杨小华，马福广，等.红细胞平均体积和脆性及血红蛋白电泳联合检测在地中海贫血诊断中的价值.中华检验医学杂志，2005,28(3)：244., http://www.100md.com(黄莲芬)