肝癌组织PTEN的表达及临床意义(2)

http://www.100md.com 2011年8月15日 《中外医学研究》 201123

     122实验方法HE染色，水洗，苏木素染色，充分水洗，盐酸酒精分色，充分水洗，氨水蓝化，充分水洗，脱水，伊红染色，脱水、透明，中性树胶封片，免疫组化PV-9000二步法检测PTEN肝癌组织中的表达，微波修复抗原，3%的H2O2室温孵育，PBS冲洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，PBS冲洗，滴加生物素标记的第二抗体，滴加链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶溶液，PBS冲洗，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，PBS冲洗，复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。

    13统计学处理采用SPSS 160统计软件包进行卡方检验，以α=0.05为检验水准，分析PTEN在肝癌组织中的表达有无统计学意义。

    2结果

    PTEN表达的50例肝癌标本中，高分化、中分化、低分化三组中，高分化19例，中分化18例，低分化13例，高中分化组表达明显高于低分化组，两组间的表达差异有统计学意义，在淋巴转移方面，50例中伴淋巴结转移者31例，不伴淋巴结转移者19例，两者表达比较差异有统计学意义。在浸润深度方面，50例中未侵及浆膜者19例，侵及浆膜者31例，统计分析，二者之间的表达差异有统计学意义。临床分期，Ⅰ期+Ⅱ期32例，Ⅲ期+Ⅳ期18例，二者间的表达差别有统计学意义。在肿瘤大小方面，肿瘤直径大于5 cm者26例，小于5 cm者24例，两者之间的表达有统计学意义。在肝癌的分化程度、淋巴结转移、浸润深度、临床分期等这些病理因素方面，PTEN的表达存在着显著差异，但是在肿瘤的大小方面，两者间的表达并无统计学意义。

    3讨论

    1997年美国3个实验室[4～6]先后在第10号染色体的同一位点发现的一种新的肿瘤抑制基因，将其命名为PTEN基因，亦称在多个进展期中均有突变的基因(mutated in multiple advancedcancers 1, MMAC1)。近年来研究发现，PTEN在肿瘤细胞中的表达异常，提示其在肿瘤的浸润以及转移机制中发挥重要作用。PTEN可以发挥抑制肿瘤发生的作用，该基因的肿瘤抑制作用是通过对PIP3去磷酸化、拮抗PI3K/Akt通路而实现的。蛋白激酶B为PTEN重要的效应分子。蛋白激酶B(AKT)可以介导PI3K的许多生物学效应，在PI3K/Akt信号通路中起核心作用。AKT聚集于细胞膜，并且与PIP3高特异性、高亲和力结合。通过这一结合作用使AKT磷酸化，从而激活AKT。活化的AKT又可使胞浆及胞核内的一系列底物发生磷酸化，如GSK3、IRS-1、 PDE-3B、 BAD、human Caspase9、 Forkhead、 NF-KB、 mTOR、 eNOS、 Raf蛋白激酶等，从而发挥其活性作用。PTEN具有双特异性磷酸酯酶活性，可以通过使PIP3去磷酸化形成PIP2，降低PIP3水平这一途径来阻断PI3K/AKT通路，促进细胞凋亡。Tamura等[7]在实验中发现，PI3K抑制剂如Wortmannin可以模拟PTEN作用于细胞周期以及p27蛋白水平，证实了PTEN是通过抑制PI3K/Akt信号通路从而促进细胞凋亡。PTEN的诱导细胞凋亡作用的另一途径与Integrin有关。PTEN在使关键的信号传导脂类脱磷酸化中起重要作用。当PTEN蛋白表达缺失时，此类脂类信号传导通路将使肿瘤细胞避免凋亡。PTEN可以抑制脂类磷酸酶活性，拮抗细胞与细胞外基质之间的相互作用，从而维持了细胞对凋亡的敏感性，在肿瘤的形成过程中，在PI3K/Akt和mitogen激活的蛋白激酶通路中，胰岛素样生长因子系统(IGF)起重要作用。Hwang等[8]通过对人类肝腺癌细胞株SUN-5和-216转染人类PTENcDNA，以评估PTEN基因在肝癌中对细胞生长及胰岛素样生长因子系统的效应。PTENcDNA转染的类肝腺癌细胞株表现出了较低的增殖率。PTEN在SUN-5和SUN-216细胞株中过度表达，并且对有etoposide、adriamycin损伤DNA诱导的死亡更加敏感。他们认为通过调节IGF系统，PTEN基因抑制肿瘤细胞的生长，并增加了肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。

    肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系统最常见肿瘤之一。近二十年来我国肝癌的死亡率增加了4117%，已成为我国第二位的肿瘤致死病因。有关HCC的影像学、手术、放化疗、肿瘤的局部治疗及生物治疗等方面都一些进展，但HCC的远期治疗效果无明显变化。目前，肝癌的发病率和死亡率仍然居高不下，由于肿瘤发病的多阶段性以及各相关因素之间交互作用的复杂性，一级预防很难在实际工作中开展。为了调查PTEN/MMAC1在肝癌的发生发展上的潜在作用，Khanna[2]等对96例肝癌患者进行10q等位基因缺失和PTEN/MMAC1基因所有编码区域微小突变的检查。结果显示96例患者中有5例检测到体细胞的突变。其中3例发生移码突变，1例在外显子4的83和84密码子处有1个碱基对的插入，2例在外显子8的318和319密码子处存在4个碱基对的缺失；另外2例有CG的颠换突变，发生在外显子1从起始密码子开始的第5非编码区的第9碱基对，但96例病人中没有发现PTEN基因的错义突变。这些发现表明，如果1个等位基因内的点突变和另一个染色体材料的丢失同时发生，PTEN/MMACI基因中就有2个等位基因被阻止。Southern杂交结果显示，所有34例肝细胞癌组织中未观察到PTEN基因限制性片段长度多态性或该基因纯合性缺失、半合性缺失和片段缺失。PCR-SSCP检测发现，有2例肝细胞癌PTEN基因第5外显子均显示有1条额外电泳迁移带，异常迁移带位置相同，提示第5外显子突变位点可能相同，但Yeh等[9]通过应用嵌合RNA的RT-PCR技术和外显子SSCP分析检测了42例原发性肝癌的PTEN/MMACI突变，42例中没有1例出现该基因的微小缺失、点突变或插入突变，其结果表明PTEN/MMACI基因在肝癌的发病机制上不起任何作用。

    总之，肝癌的浸润和转移是一个多阶段、连续、复杂的病理过程。随着对抑癌基因PTEN的研究的深入，其与肿瘤转移的密切相关性已为越来越多的研究者所认同，目前可以肯定PTEN在促进肝癌转移方面，存在着多种复杂机制。PTEN也很可能通过多种途径增强肝癌的侵袭与转移。

    参考文献

    [1]Yu Y, Khan J, Khanna C, et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organiz-er PTEN and the developmental homeopmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators.Nat Med,2004,10(2):175-181

    [2]Khanna C, Wan X, Bose S, et al.The membrane cytoskeleton linker PTEN is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med, 2004, 10(2):182-186

    [3]Tachibana M, Shibakita M, Ohno S, et al.Expression and prognostic significance of PTEN product protein in patients with esophageal squamous cell carcinoma.Cancer,2002,94(7):1955-1960.(赵世福,赵玉玲,刘书峰)

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