陈星,周哲旭,尚艺婉,刘洋,刘娅茹,胡啸博,樊李妍,陈玉龙

    河南中医药大学/河南省中医方证信号传导重点实验室,河南 郑州 450046

    食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,在全球癌症相关死亡原因中排第六位,我国食管癌的发病率与病死率较高[1-2]。目前,针对食管癌患者的主要治疗手段是放化疗及联合手术,但由于大多数患者在晚期确诊,导致其5年生存率极低[3-4]。多项研究表明,信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路参与了食管癌的发生和发展,促进肿瘤细胞的增殖、迁移、抗凋亡、抗耐药等,严重影响其预后,已成为食管癌治疗的潜在靶点[5-9]。丹参酮ⅡA作为中药丹参的有效成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗纤维化、抗动脉粥样硬化、抗癌等作用[10-11]。研究证实,丹参酮 ⅡA 可以通过抑制上皮间质转化促进食管癌EC9706和KYSE70细胞凋亡,抑制其侵袭、迁移[12]。同时,丹参酮ⅡA可以通过下调p-STAT3抑制人胃癌细胞的增殖[13]。前期预实验发现,不同浓度的丹参酮ⅡA能够有效抑制STAT3、p-STAT3的表达,并且随浓度梯度抑制食管癌Ec109细胞的增殖。但是丹参酮ⅡA能否通过抑制STAT3通路促进食管癌细胞周期阻滞进而促进其凋亡尚未见报道。基于此,本实验拟从丹参酮ⅡA抑制食管癌细胞Ec109增殖的基础上,探讨其能否通过抑制STAT3信号通路发挥其抗肿瘤作用,为食管癌的临床治疗提供新的思路与靶点。

    1 材料

    1.1 动物与细胞人食管癌Ec109细胞,由本实验室传代冻存。70只4周龄SPF级BALB/c雌鼠,体质量11～15 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:NO.110011220106561335,实验动物许可证号:SCXK(京)2021-0006。动物饲养于河南中医药大学动物实验中心(23±2) ℃的SPF动物房中,动物实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准,伦理编号:ZWLL202003215。

    1.2 药物与试剂STAT3抑制剂stattic(Selleckchem公司,批号:S7024);丹参酮ⅡA(质量分数≥98%,成都曼斯特公司,批号:568-72-9);RPMI Medium1640培养基(美国Gibico公司,批号:2357161);胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶不含EDTA消化液、四甲基偶氮唑盐(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、高效RIPA裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂混合物(北京索莱宝科技有限公司,批号:T1300、T1350、M8180、D8370、R0010、P0100、P1260);胎牛血清(Hyclone公司,货号:RB39736);STAT3鼠抗人抗体、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)鼠抗人抗体、c-Myc兔单克隆抗体、CyclinB1抗体、α-tublin兔单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗(美国CST公司,货号:9145S、9508S、18583S、4138S、2125S、7056S、7074S);p-STAT3兔抗人抗体、caspase-3兔抗人抗体(英国Abcam公司,货号:ab76315、ab32351);细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,货号:A20533、A10642);Trizol试剂(美国invitrogen公司,批号:390202);逆转录试剂盒(东洋纺公司,批号:117000);2×SYBRGreen(ABclonal公司,批号:9620031031C) ......