hepaCAM基因对结肠癌细胞增殖和周期的影响(1)
摘要：目的：研究hepaCAM基因对结肠癌细胞Colo205增殖和周期的影响。方法：用腺病毒向结肠癌细胞Colo205导入肝细胞黏附分子(Hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM)，以RT-qPCR及westernblot检测hepaCAMmRNA及蛋白水平，MTT测细胞生存率，FCM测细胞周期及凋亡。结果：RT-qPCR及westernblot显示：hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中呈现低表达状态，向细胞导入hepaCAM基因后，MTT显示：实验组生存率显著降低(P<0.01)。FCM证实：实验组出现明显G2/M期阻滞，但细胞凋亡尚未到达统计学意义。结论：hepaCAM基因可显著抑制人类结肠癌Colo205细胞的增殖，并将细胞阻滞于G2/M期，从而产生抗肿瘤作用。
关键词：结肠癌;肝细胞黏附分子;抑制率;细胞周期
中国图书分类法分类号：
, 百拇医药 文献标志码：
收稿日期：
AbstracT：Objective：Toinvestigatethebiologicaleffectsofhepa-tocytecelladhesionmolecule
macellColo205.Methods：AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAMorpAdH5，sofhepaCAM，MTTassaywasusedtoobservethesurvivalratesofcellsindifferentgroups，FCMwasusedtoanalyzethechangesofcellcycleandapoptosisinColo205.Results：PCRandwesternblotshowedthatmRNAandproteinlevelsofhepaCAMweredown-regulatedinColo205.AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAM，expressionlevelofhepaCAMwasup-regulateddramatically.MTTassayshowedthatthesurvivalratewasmarkedlydecreased
, http://www.100md.com
2/MphasearrestwasseeninpAdH5-hepaCAMgroup.Conclusion：AfterintroductionofhepaCAMgene，ndG2/Mphasearrestcanbeobserved，whichmightbethereasonoftumorsuppressionbyhepaCAMinhumancoloncarcinomacell.
Keywords：carcinomaofcolon;hepa-tocytecelladhesionmolecule;inhibitionrate;cellcycle
结肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国结肠癌的发病率有明显增高的趋势。由于结肠癌常起病隐匿，许多患者获得诊断时肿瘤已出现了不同程度的扩散与转移[1，2]。尽管各种治疗决策不断改进，但结肠癌的治疗仍然是一大挑战[1]。基因突变已经被确认为癌症发生的重要标志，因此，开展结肠癌基因治疗研究具有重大意义。ShaliS[3]等研究发现肝细胞黏附分子(hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM)是一种免疫球蛋白类细胞黏附分子，它具有抑制肿瘤生长及增殖的作用。它在乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中表达水平明显下降，上调其表达可显示出显著的肿瘤抑制效应[4-7]。而hepaCAM在结肠癌中的研究目前尚存在空白。本研究将检测hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中的表达水平，并将外源性hepaCAM基因导入Colo205细胞，观察其对肿瘤细胞增殖与周期的影响，为结肠癌的基因治疗探索新的思路。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1材料
腺病毒pAdH5-hepaCAM、空载腺病毒pAdH5及结肠癌细胞系Colo205由本室保存。Trizol、逆转录试剂盒、SYBRGreenⅡ荧光定量PCR试剂盒及DNAmarker购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由Invitrogen公司合成。MTT、胰酶、二甲基亚砜购自Sigma公司。hepaCAM抗体购自LifespanBiosciences公司。β-actin抗体购自SantaCruz公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及腺病毒感染。待Colo205细胞复苏后，置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中细胞长至70%时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入无血清的RPMI-1640培养液，滴入病毒，放入培养箱培养，半小时后将培养瓶中的培养液轻轻摇匀，继续培养，1.5h后向培养瓶中加入等量的含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，感染24h后观察细胞病变(CPE)。将细胞分为3组：实验组(Colo205/pAdH5-hepaCAM组)、空载组(Colo205/pAdH5组)和空白对照组(Colo205组)，以备后续实验。
, 百拇医药
1.2.2实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测hepaCAM基因的mRNA含量。用Trizol提取不同组的总RNA，用逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA，并于-20℃备用。根据hepaCAM、β-actin的序列设计其引物，以β-actin为内参。hepaCAM正义链：5’-TACTGTAGATGTGCCCATTTCG-3’，反义链：5’-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3’，产物长度461bp;β-actin正义链：5’-ACGAGACCACCTTCAACTCCATC-3’，反义链：5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA-3’，产物长度304bp。HepaCAM的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。β-actin的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。, 百拇医药(刘琦 徐新 林玲)
关键词：结肠癌;肝细胞黏附分子;抑制率;细胞周期
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, 百拇医药 文献标志码：
收稿日期：
AbstracT：Objective：Toinvestigatethebiologicaleffectsofhepa-tocytecelladhesionmolecule
macellColo205.Methods：AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAMorpAdH5，sofhepaCAM，MTTassaywasusedtoobservethesurvivalratesofcellsindifferentgroups，FCMwasusedtoanalyzethechangesofcellcycleandapoptosisinColo205.Results：PCRandwesternblotshowedthatmRNAandproteinlevelsofhepaCAMweredown-regulatedinColo205.AfterinfectedwithadenoviruspAdH5-hepaCAM，expressionlevelofhepaCAMwasup-regulateddramatically.MTTassayshowedthatthesurvivalratewasmarkedlydecreased
, http://www.100md.com
2/MphasearrestwasseeninpAdH5-hepaCAMgroup.Conclusion：AfterintroductionofhepaCAMgene，ndG2/Mphasearrestcanbeobserved，whichmightbethereasonoftumorsuppressionbyhepaCAMinhumancoloncarcinomacell.
Keywords：carcinomaofcolon;hepa-tocytecelladhesionmolecule;inhibitionrate;cellcycle
结肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，近年来，我国结肠癌的发病率有明显增高的趋势。由于结肠癌常起病隐匿，许多患者获得诊断时肿瘤已出现了不同程度的扩散与转移[1，2]。尽管各种治疗决策不断改进，但结肠癌的治疗仍然是一大挑战[1]。基因突变已经被确认为癌症发生的重要标志，因此，开展结肠癌基因治疗研究具有重大意义。ShaliS[3]等研究发现肝细胞黏附分子(hepa-tocytecelladhesionmolecule，hepaCAM)是一种免疫球蛋白类细胞黏附分子，它具有抑制肿瘤生长及增殖的作用。它在乳腺癌、肾癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中表达水平明显下降，上调其表达可显示出显著的肿瘤抑制效应[4-7]。而hepaCAM在结肠癌中的研究目前尚存在空白。本研究将检测hepaCAM基因在结肠癌细胞Colo205中的表达水平，并将外源性hepaCAM基因导入Colo205细胞，观察其对肿瘤细胞增殖与周期的影响，为结肠癌的基因治疗探索新的思路。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1材料
腺病毒pAdH5-hepaCAM、空载腺病毒pAdH5及结肠癌细胞系Colo205由本室保存。Trizol、逆转录试剂盒、SYBRGreenⅡ荧光定量PCR试剂盒及DNAmarker购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由Invitrogen公司合成。MTT、胰酶、二甲基亚砜购自Sigma公司。hepaCAM抗体购自LifespanBiosciences公司。β-actin抗体购自SantaCruz公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及腺病毒感染。待Colo205细胞复苏后，置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。当培养瓶中细胞长至70%时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入无血清的RPMI-1640培养液，滴入病毒，放入培养箱培养，半小时后将培养瓶中的培养液轻轻摇匀，继续培养，1.5h后向培养瓶中加入等量的含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，感染24h后观察细胞病变(CPE)。将细胞分为3组：实验组(Colo205/pAdH5-hepaCAM组)、空载组(Colo205/pAdH5组)和空白对照组(Colo205组)，以备后续实验。
, 百拇医药
1.2.2实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测hepaCAM基因的mRNA含量。用Trizol提取不同组的总RNA，用逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA，并于-20℃备用。根据hepaCAM、β-actin的序列设计其引物，以β-actin为内参。hepaCAM正义链：5’-TACTGTAGATGTGCCCATTTCG-3’，反义链：5’-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3’，产物长度461bp;β-actin正义链：5’-ACGAGACCACCTTCAACTCCATC-3’，反义链：5’-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA-3’，产物长度304bp。HepaCAM的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。β-actin的PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共40个循环。, 百拇医药(刘琦 徐新 林玲)