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编号:11736716
HPLC法测定清肝颗粒中小檗碱的含量
HPLC法测定清肝颗粒中小檗碱的含量
HPLC法测定清肝颗粒中小檗碱的含量


     摘要:目的 建立测定清肝颗粒中盐酸小檗碱含量的高效液相色谱法。方法 以Kromasil C18柱(5μm,4.6mm×250mm)为色谱柱,流动相为乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2),流速为1.0mL/min ,检测波长为350nm。结果 盐酸小檗碱线性范围为0.04125~0.660μg,r=0.9999;平均回收率为99.21% ,RSD 为1.18%。结论 该方法可靠,灵敏,快速,适合测定清肝颗粒中盐酸小檗碱的含量。

    关键词 清肝颗粒 盐酸小檗碱 HPLC

    Determination of Berberine Hydrochloride in Qinggan Granule by HPLC.Liu Chun-di,Liu Xiao-yan,Yu hui.The ZhangJiagang’s hospital of TCM,ZhangJia gang 215600,Jiang Su,China.

    【Abstact】Objective To establish HPLC method for the determination of berberine hydrochloride in Qinggan Granule.Mehod The KromasilCl8(4.6mmX 250mm,5μm)was usedwith acetonitrile— 0.05mol·L~ Potassium dihydrogen phosphate solution—phosphoric acid(40:60:0.2)as a mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detecting wavelength was350nm .Results The linear of berberine hydrochloride was in the range of 0.04125~0.660g,r=0.9999.The average recovery was 99.21% and RSD was 1.18%.Conclusion Themethod was reliable, sensitive,rapidand suitable for the quality control of berberine hydrochloride in Qinggan Granule.

    【Key Words】 Qinggan Granule;berberine hydrochloride; HPLC

    肠易激综合症(Irritable bowel syndrome,IBS)是一种十分常见的慢性、非器质性胃肠功能紊乱症状, 临床以腹痛及大便性状改变为主要表现[1]。该症普通人群患病率较高,清肝颗粒即针对该症,方中以黄连为君药,现代研究表明黄连药效物质基础为黄连生物碱,包括小檗碱(berberine),黄连碱(coptisine),甲基黄连碱(worenine),掌叶防己碱(palmatine)等。其中小檗碱含量最高,小檗碱是中药黄连(Coptis chinensis Franch)中的主要生物碱和药效成分[2],含量约为7%~9% [3] ,具有抗菌、抗炎、抗血栓、抗溃疡、降血糖等药理作用[4],故选择小檗碱为含量测定指标,我们参考现行版中国药典一部“左金胶囊”项下小檗碱含量测定方法,采用HPLC法测定本制剂中小檗碱的含量,方法可靠、灵敏、快速。

    1 仪器及试药

    1.1 仪器 Waters 515泵,Waters 2487紫外-可见检测器,Rheodyne 进样器,中科院大连化学物理所WDL-95色谱工作站。

    1.2 试药 盐酸小檗碱(中国药品生物制品检定所,批号:10713-200208,供含量测定用);乙腈为高效液相色谱纯(美国默克公司生产),磷酸(AR)、磷酸二氢钾(AR),其余试剂均为分析纯。

    2 方法与结果

    2.1 色谱条件 色谱柱:反相C18柱:Kromasil C18柱(5μm,4.6mm×250mm);柱温:30℃;流动相:乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2);检测器灵敏度:0.5AUFS。流速:1.0mL/min。测定波长:350nm。

    2.2 溶液制备

    2.2. 1 对照品溶液 精密称取小檗碱对照品1.32mg,加甲醇定容至10ml,配成0.132mg/ml的对照品溶液。

    2.2.2 供试品溶液[5] ① 提取溶媒的考察:精密称取清肝颗粒约0.5g,分别加1%盐酸甲醇、甲醇、80%甲醇、70%乙醇超声处理,加甲醇至刻度,摇匀,取3mL离心(10000r/分) 10分钟,取上清液按上述色谱条件分析,结果表明1%盐酸甲醇提取率最高,故选择1%盐酸甲醇为提取溶媒。② 超声时间的考察:精密称取清肝颗粒约0.5g,加1%盐酸甲醇,分别超声处理10、20、30分钟,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,取3mL离心(10000r/分) 10分钟,取上清液按上述色谱条件分析,结果表明超声20min提取率最高,故选择超声时间为20min。

    根据上述结果确定本品供试液的制备方法为:精密称取清肝颗粒约0.5g,加1%盐酸甲醇100mL,超声处理20分钟,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,取3mL离心(10000r/分) 10分钟,即得供试液。

    2.2.3 阴性对照溶液 按清肝颗粒制剂处方,去黄连,按制剂工艺制成缺黄连阴性颗粒。精密称取约0.5g,按供试液制备法制备。

    2.3 空白试验 取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液按上述色谱条件进样,色谱图见图 1、图 2和图 3。由图可见,缺黄连样品色谱在小檗碱相应保留时间上没有干扰峰,图 2和图 3中小檗碱和样品中其它组分色谱峰达到基线分离,小檗碱与相邻色谱峰的分离度大于1.5;按小檗碱峰计算,理论塔板数(N)大于8000。

    2.4 线性关系的考察 取对照品溶液,再依次配成0.066mg/mL、0.033mg/mL、0.0165mg/mL、0.00825mg/mL系列对照品液。用5μL定量管的液相色谱仪进样器进样,以峰面积为纵座标(Y),对照品量(μg)为横座标(X)进行线性回归,得回归方程: Y = 3718055.6X-26325.2,R2 = 1.0。结果表明小檗碱进样量在0.04125~0.660μg范围内呈良好线性关系。

    2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液5μL,重复进行5次,测得主峰峰面积,计算RSD为1.53%(n=5),表明精密度良好。

    2. 6 灵敏度试验 取对照品溶液依法稀释进样,得最低检测限为2ng(S/N=3)。

    2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液5μL,分别于0、2、6、8及12h进行测定,结果12h内测定结果稳定,RSD为1.15%。

    2.8 重复性试验 取同批样品(批号:20050820)5份,按供试液制备法制备,得5份供试液,依法测定,结果表明该法重复性良好,RSD为0.33%。

    2.9 加样回收率试验 取重复性试验中含量已测定的清肝颗粒进行加样回收试验。精密称取约0.2~0.3g共六份,分别加入小檗碱对照品(样品含量的100%、80%和120%),按供试液制备法制备得6份供试液,依法测定计算含量,平均回收率为99.21%,RSD为1.18%。测定结果见表1。

    2.10 样品测定 按拟定的含量测定方法,分别测定三批样品,以外标一点法计算测定小檗碱含量,结果见表2。

    3 讨论

    3.1 黄连为清肝颗粒方中的主药之一,从所测的3批样品的数据可知,其含盐酸小檗碱的量均能达到《中国药典)2005年版一部黄连项下的要求。故此法可作为控制此药品质量的一个重要指标。

    3.2 检测波长的选择 盐酸小檗碱在 350nm处有最大吸收 ,灵敏度高,且杂质无干扰,故选择 350nm 为检测波长。

    3.3 小檗碱是季胺型生物碱,极性较大,参考文献以不同比例的乙腈,磷酸二氢钾水溶液及磷酸为流动相。结果以“乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾水溶液-磷酸(40:60:0.2)”出峰时间短,峰形对称,故选为流动相。

    3.4 实验中对提取方法中的提取溶媒、超声时间进行了考察 。结果表明 :以1%盐酸甲醇、超声处理20分钟时,盐酸小檗碱提取率最高 。

    参考文献:

    [1] 徐春雷.肠易激综合症的临床治疗观察,海南医学,2005,16(9):92.

    [2] 黄泰康.常用中药成分与药理手册.北京:中国医药科技出版社,1994,4.

    [3] 高学敏.中药学上册.北京:人民卫生出版社,2000.

    [4] 吕霞,王晶,等.黄连的研究进展.山东医药工业,2003,22(6):33-35.

    [5] 中华人民共和国药典一部[s].北京:化学工业出版社,2005:214.(柳春娣 刘晓燕 余 辉)
    婵犵數濮烽弫鎼佸磿閹寸姴绶ら柦妯侯棦濞差亝鍋愰悹鍥皺椤︻厼鈹戦悩缁樻锭婵炲眰鍊濋、姘舵焼瀹ュ棛鍘卞┑鐐村灥瀹曨剟寮搁妶鍡愪簻闁冲搫鍟崢鎾煛鐏炲墽鈽夐柍钘夘樀瀹曪繝鎮欏顔介獎闂備礁鎼ˇ顐﹀疾濠婂吘娑㈠礃椤旇壈鎽曞┑鐐村灦鑿ら柡瀣叄閻擃偊宕堕妸锕€鐨戦梺绋款儐閹歌崵绮嬮幒鏂哄亾閿濆簼绨介柛鏃撶畱椤啴濡堕崱妤€娼戦梺绋款儐閹瑰洭寮诲☉銏″亹鐎规洖娲㈤埀顒佸笚娣囧﹪宕f径濠傤潓闂佸疇顫夐崹鍨暦閸洖鐓橀柣鎰靛墰娴滄瑩姊虹拠鏌ヮ€楃紒鐘茬Ч瀹曟洟宕¢悙宥嗙☉閳藉濮€閻橀潧濮︽俊鐐€栫敮鎺椝囬鐐村€堕柨鏃傜摂濞堜粙鏌i幇顒佲枙闁稿孩姊归〃銉╂倷閸欏鏋犲銈冨灪濡啫鐣烽妸鈺婃晣闁绘劙娼ч幖绋库攽閻樺灚鏆╅柛瀣█楠炴捇顢旈崱妤冪瓘闂佽鍨奸悘鎰洪鍕吅闂佺粯锚閸氣偓缂佹顦靛娲箰鎼达絿鐣甸梺鐟板槻椤戝鐣烽悽绋块唶婵犮埄浜濆Λ鍐极閸屾粎椹抽悗锝庝簻婵″ジ姊绘担鍛婃喐闁稿鍋ら獮鎰板箮閽樺鎽曢梺鍝勬储閸ㄥ綊鐛姀銈嗙厸闁搞儮鏅涘瓭婵犵鈧尙鐭欓柡宀嬬秮婵偓闁宠桨鑳舵禒鈺冪磽閸屾氨孝闁挎洦浜悰顔界節閸ャ劍娅㈤梺缁樓圭亸娆撴偪閳ь剚淇婇悙顏勨偓鏍箰妤e啫纾婚柣鏂挎憸椤╃兘鏌熼幍顔碱暭闁抽攱鍨块弻娑㈡晜鐠囨彃绗岄梺鑽ゅ枑閸f潙煤椤忓嫀褔鏌涢妷顔惧帥婵炶偐鍠栧娲礃閸欏鍎撻梺鐟板暱濮橈妇鎹㈠鑸碘拻濞达絽鎳欒ぐ鎺戝珘妞ゆ帒鍊婚惌娆撴煙閻戞﹩娈曢柛濠傜仛閵囧嫰寮崹顔规寖缂佺偓鍎抽妶鎼佸蓟閿熺姴绀冮柕濞垮劗閸嬫挾绮欓幐搴㈢槑濠电姷鏁告慨顓㈠箯閸愵喖绀嬮柛顭戝亞閺夊綊鏌f惔銏╁晱闁哥姵鐗犻幃銉╂偂鎼达絾娈惧┑顔姐仜閸嬫挸鈹戦埄鍐憙妞わ附濞婇弻娑㈠箻閺夋垹浠哥紓浣虹帛缁嬫捇鍩€椤掍胶鈯曞畝锝呮健閹本绻濋崑鑺ユ閹晠宕f径瀣瀾闂備浇妗ㄧ欢锟犲闯閿濆鈧線寮撮姀鈩冩珕闂佽姤锚椤︿粙鍩€椤掍胶鈽夐柍瑙勫灴閺佸秹宕熼锛勬崟濠电姭鎷冮崨顔界彧缂備緡鍠楅悷锔炬崲濠靛鐐婇柕濞у啫绠版繝鐢靛О閸ㄧ厧鈻斿☉銏℃櫇闁靛牆顦Ч鏌ユ煛閸モ晛鏋戦柛娆忕箻閺岋綁鎮㈤悡搴濆枈濠碘槅鍨崑鎾绘⒒娴h姤銆冪紒鈧担铏圭煋闁圭虎鍠楅崑鈺傜節闂堟侗鍎忕紒鈧崘鈹夸簻妞ゆ挾鍠庨悘锝夋煙鐎电ǹ鍘存慨濠勭帛閹峰懐绮电€n亝鐣伴梻浣告憸婵敻骞戦崶褏鏆︽繝闈涳功閻も偓濠电偞鍨兼ご鎼佸疾閿濆洨纾介柛灞剧懅閸斿秴鐣濋敐鍛仴闁糕斂鍨藉顕€宕奸悢鍝勫箺闂備胶鎳撻顓㈠磿閹寸偟鐟规繛鎴欏灪閻撴洟鏌¢崒姘变虎闁哄棴缍侀弻鈥崇暆鐎n剛鐦堥悗瑙勬礃鐢帡锝炲┑瀣垫晣闁绘﹢娼ч獮鈧紓鍌氬€搁崐鐑芥倿閿曞倶鈧啴宕ㄥ銈呮喘閺屽棗顓奸崨顖氬Е婵$偑鍊栫敮鎺楀窗濮橆兗缂氶柟閭﹀枤绾惧吋銇勯弮鍥т汗缂佺姴顭烽弻銊モ攽閸繀妲愰梺杞扮閸熸潙鐣烽幒鎴僵闁告鍋為幉銏ゆ⒒娴h棄鍚瑰┑鐐╁亾缂傚倸鍊归懝楣冨煝瀹ュ鏅查柛銉㈡櫇閻撳姊洪崜鑼帥闁哥姵鎹囬崺鈧い鎺嶇缁楁帗銇勯锝囩疄妞ゃ垺锕㈤幃鈺咁敃閿濆孩缍岄梻鍌氬€风欢姘缚瑜嶇叅闁靛牆鎮垮ú顏勎╅柍杞拌兌閸旓箑顪冮妶鍡楃瑨闁稿妫濆銊╂偋閸垻顔曟繝銏f硾椤戝洤煤鐎电硶鍋撶憴鍕8闁搞劏濮ゆ穱濠囧醇閺囩偟鍊為梺闈浨归崕鐑樺閺囥垺鐓熼柣鏂挎憸閻苯顭胯椤ㄥ牓寮鍢夋棃宕崘顏嗏棨濠电姰鍨奸崺鏍礉閺嶎厼纾婚柨婵嗩槹閻撴洟鏌曟径妯虹仩妞も晩鍓欓埥澶愬箻閻熸壆姣㈢紓浣介哺鐢岣胯箛娑樜╃憸蹇涙偩婵傚憡鈷戠憸鐗堝俯濡垵鈹戦悙鈺佷壕闂備浇顕栭崰妤冨垝閹捐绠板┑鐘插暙缁剁偛顭跨捄铏圭伇婵﹦鍋撶换婵嬫偨闂堟稐绮跺銈嗘处閸樹粙骞堥妸锔哄亝闁告劑鍔嶅Σ顒勬⒑閸濆嫮鈻夐柛妯恒偢瀹曞綊宕掗悙瀵稿帾婵犵數鍋熼崑鎾斥枍閸℃稒鐓曢悗锝冨妼婵″ジ妫佹径鎰叆婵犻潧妫欓崳褰掓煛閸℃瑥鏋戝ǎ鍥э躬椤㈡稑顫濋崡鐐╁徍婵犳鍠栭敃銉ヮ渻娴犲鈧線寮撮姀鈩冩珳闂佺硶鍓濋悷锕傤敇婵犳碍鈷掑ù锝堟鐢盯鏌熺喊鍗炰簽闁瑰箍鍨归埞鎴犫偓锝庡墮缁侊箓鏌f惔顖滅У闁哥姵鐗滅划濠氭晲閸℃瑧鐦堟繝鐢靛Т閸婃悂顢旈锔界厵闁哄鍋勬慨鍌涙叏婵犲啯銇濇鐐村姈閹棃鏁愰崒娑辨綌闂傚倷绀侀幖顐︽偋濠婂牆绀堥柣鏃堫棑閺嗭箓鏌i悢绋款棎闁割偒浜弻娑㈠即閵娿儱瀛e┑鐐存綑鐎氼剟鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冾殘閻熸劙姊虹紒妯洪嚋缂佺姵鎸搁锝夊箮缁涘鏅滈梺鍓插亞閸犳捇宕㈤柆宥嗏拺闁荤喓澧楅幆鍫㈢磼婢跺缍戦柣锝囨暬瀹曞崬鈽夊▎鎴濆笚闁荤喐绮嶇划鎾崇暦濠婂喚娼╂い鎺戭槹閸嶇敻姊洪棃娴ュ牓寮插⿰鍫濈;闁稿瞼鍋為悡銉╂煟閺傛寧鎯堢€涙繈鏌i悢鍝ユ嚂缂佺姵鎹囬悰顕€寮介鐐殿啇濡炪倖鎸鹃崑鐔哥椤栨粎纾藉ù锝嗗絻娴滅偓绻濋姀锝嗙【闁愁垱娲濋妵鎰板箳閹寸媭妲梻浣呵圭换妤呭磻閹邦兘鏋旈柕鍫濐槹閳锋垹绱撴担璐細缂佺姵鐗犻弻锝夊煛婵犲倻浠╅梺浼欑悼閸忔﹢寮幘缁樺亹闁肩⒈鍓﹀Σ浼存⒒娴h棄浜归柍宄扮墦瀹曟粌顫濇0婵囨櫓闂佺鎻梽鍕煕閹达附鍋i柛銉岛閸嬫捇鎼归銈勭按闂傚倷绀侀幉锟犲蓟閵婏富娈介柟闂寸閻撴繈鏌熼幑鎰靛殭缂佺媴缍侀弻锝夊箛椤撶喓绋囧銈呭閹告悂鍩為幋锔藉亹閻犲泧鍐х矗闂備礁鎽滈崳銉╁垂閸洜宓侀柛鈩冪☉绾惧吋鎱ㄩ敐搴″箹缂傚秴锕獮鍐煛閸涱厾顔岄梺鍦劋缁诲倹淇婇柨瀣瘈闁汇垽娼цⅴ闂佺ǹ顑嗛幑鍥蓟閻斿皝鏋旈柛顭戝枟閻忔挾绱掓ィ鍐暫缂佺姵鐗犲濠氭偄鐞涒€充壕闁汇垻娅ラ悷鐗堟瘎闂佽崵鍠愮划搴㈡櫠濡ゅ懏鍋傞柨鐔哄Т閽冪喐绻涢幋娆忕仼缂佺姵濞婇弻锟犲磼濮樿鲸鐨戦梺鍝勵儏閹冲酣鍩為幋锔藉€烽柛娆忣槸濞咃綁姊绘担绋跨盎缂佽尙鍋撶粚杈ㄧ節閸パ咁啋濡炪倖妫佹慨銈呪枍閵忋倖鈷戦悹鎭掑妼濞呮劙鏌熼崙銈嗗

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