不同浓度川芎嗪对人翼状胬肉成纤维细胞的作用
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川芎嗪是从伞形科植物川芎的根茎中提取的有效成分，化学名为四甲基吡嗪，临床应用广泛，主要用于心脑血管等疾病的治疗。近年来，川芎嗪在眼科基础和临床研究的报道日益增多，如视网膜色素变性、青光眼、糖尿病视网膜病变等[1-4]。有研究表明，川芎嗪能有效抑制成纤维细胞的增生[5-6]。由于川芎嗪在酸性条件下溶解度较高，而在中性条件下，同样浓度的川芎嗪不易溶解，易析出。故本实验观察两种pH(7.40和6.00)条件下，川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的干预作用，为川芎嗪的基础研究提供研究数据，为翼状胬肉的防治提供疗效好的现代中药。
1材料和方法
1.1主要试剂仪器 RPMI 1640培养基(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰蛋白酶(AMRESCO， 生工生物工程有限公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(华美生物有限公司)、盐酸川芎嗪(西安力邦制药有限公司, 061001B)、注射用丝裂霉素(Kyowa Hakko Kogyo Co.Ltd)、四甲基偶氮唑盐(MTT)(MBCHEN公司)、40%甲醛(广州化学试剂厂)、Vimentin小鼠单抗(Santa Cruz公司)、Cy3标记二抗(Jackson公司)、CO2培养箱(德国宾德公司)、超净工作台(苏净集团安泰公司制造)、倒置显微镜(Carl ZEISS公司， Axinvert 200)、酶联免疫检测仪(BioTeK ELX-800)、紫外线分光光度计(日本SHIMADZU UV mini1240)、pH计(Sartorius PB-10)、荧光显微镜(Carl ZEISS公司， Axioplan 2 imaging)。
1.2方法
1.2.1川芎嗪的配制方法：称取一定量川芎嗪药粉溶于无血清的RPMI 1640培养基中，配置终浓度为4.0mg/ml的川芎嗪药液；然后采用倍比稀释法依次配置终浓度分别是4.0mg/ ml、2.0mg/ ml、1.0mg/ ml、0.5mg/ ml和0.25mg/ ml的川芎嗪药液，以pH计调节pH值为7.40和6.00的川芎嗪药液各一套，并调节相应pH值的RPMI 1640培养液各一份。
1.2.2翼状胬肉成纤维细胞体外培养及鉴定
1.2.2.1原代培养： 翼状胬肉组织标本来自中山大学中山眼科中心的翼状胬肉手术患者。本次实验采用在无菌条件下尽量将胬肉组织剪成小块，以1:1比例胰蛋白酶( 0.25% ) 和Ⅱ型胶原酶 ( 0.02% ) 混合液消化组织块40分钟，终止消化离心后，沉淀物用RPMI 1640培养基混合吹打均匀接种6孔板后，放入5%CO2培养箱中，37℃培养。RPMI 1640培养基内含15%灭活胎牛血清及青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。原代接种后每天在倒置显微镜下观察接种细胞贴壁生长情况，3～5天换液一次。
1.2.2.2代培养：培养的原代细胞生长至80%汇合时，以0.25%的胰蛋白酶消化3 min，细胞悬液按1：2分瓶接种，完成一次传代。
1.2.2.3翼状胬肉成纤维细胞的鉴定：通过细胞的生长形态鉴定和波形蛋白免疫组化染色鉴定。间接免疫荧光组化染色鉴定方法：细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔培养板内，细胞爬满片后，4%的中性甲醛固定，抗原复性，3%过氧化氢阻断内源酶，正常羊血清封闭，加入波形蛋白抗体，4℃冰箱过夜，PBS洗涤后，加入Cy3标记的二抗1h，PBS洗涤，晾干，甘油封片，荧光显微镜观察。
1.2.3 川芎嗪对培养的翼状胬肉成纤维细胞影响的观察
1.2.3.1培养细胞的形态观察：不同浓度川芎嗪药液作用48h后，在倒置显微镜下观察翼状胬肉成纤维细胞的形态变化，在高倍镜下随机选5个视野，计数，并照相。
1.2.3.2四甲基偶氮唑盐(MTT)比色试验[7]：取3代培养的翼状胬肉成纤维细胞，用含15%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基制成细胞悬液，以105/ml的密度接种于96孔板中，每孔为200μl。培养24h后，弃去原培养液，相应每孔加入终浓度为4.0mg/ml、2.0mg/ ml、1.0mg/ ml、0.5mg/ ml和0.25mg/ ml的川芎嗪药液，0.02%MMC和不含胎牛血清RPMI 1640培养基，每孔各加200μl。 每组设3个复孔，培养48h后，在遮光条件下每孔加入5mg/ml的MTT液20μl，继续孵育4h，弃除各孔中的液体，相应各孔加入二甲基亚砜200μl，振荡10min，酶联免疫监测仪双波长模式(570nm、630nm)测各孔吸光度A值。细胞存活率=实验组A值/正常对照组A值。
1.3统计学分析
采用SPSS 11.0医学统计软件分析试验数据，结果以均数±标准差表示；同时采用方差分析进行各组均数的总体比较和两两之间比较，检验水平α=0.05。
2. 结果
2.1 体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的形态学特征
倒置显微镜下观察，传3代以上细胞在形态上无明显差异，均为贴壁生长，呈长梭形，胞核近圆形，位于细胞中央，胞体透亮，有的有分支突起。当细胞完全汇合后，呈漩涡状或放射状排列，细胞边界不清。培养的细胞爬片经间接免疫荧光技术检测细胞胞质中波形蛋白染色阳性，胞浆呈棕红色，结合培养细胞形态学特征及生长特性，可以确定培养的细胞为所需的成纤维细胞。见图1。
2.2 川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的影响
2.2.1川芎嗪对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用
在pH值为7.40和6.00的条件下，4mg/mL的川芎嗪药液处理组和0.02%MMC与其它浓度川芎嗪处理组及正常对照1640培养基处理组比较，体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞数量明显减少，P<0.001，光镜下呈现胬肉细胞部分胞体破裂、溶解，细胞收缩、变圆，变小、数量减少，0.02%MMC的作用与其相似。在pH值为7.40条件下， 2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml的川芎嗪处理组与正常对照组比较，对人翼状胬肉成纤维细胞的生长无明显差别，P>0 ......
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