川芎嗪对肝星状细胞TGF -β1及其Ⅰ\Ⅱ型受体mRNA与NF-κB表达的影响(2)
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1.4方法
1.4.1细胞培养Lx-2细胞株为表型活化的HSC。采用含10% 小牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液，常规培养于37℃、5% CO2培养箱中，每3~4d 传代1次。
1.4.2实验分组实验分为TMP组、阳性对照组、阴性对照组。其中TMP组包括50mg/L、200mg/L、800mg/L五个剂量组；阳性对照组选择苦参素作为阳性对照药物，用药剂量为500mg/L；阴性对照组，加入等容量不含药物的培养液。
1.4.3 免疫组化SP法检测HSC中NF-κB表达的核转移以1×104 ml-1 细胞悬液接种于24孔培养板，制备细胞爬片。预培养24h后分别按拟定剂量加入各组药物，继续培养48h。SP免疫细胞化学染色检测NF-κB的表达，抗NF-κB p65抗体稀释度1:100根据染色结果分析NF-κB表达的核转移。
1.4.4RT-PCR法检测HSC中TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体mRNA表达制备细胞爬片，分别加入各组药物后继续培养48h。引物设计，根据Genebank中人TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体的mRNA或cDNA基因序列，采用Primer Premier 5软件设计RT-PCR测定所需引物序列：GAPDH(212bp)A：5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，S：5’-GAACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’；TGF-β1(321bp)A：5’-CTAAGGCGAAAGCCCTCAAT- 3’，S：5’-GCAGGAAACCCACAACGAA-3’；TβRⅠ(287bp)A：5’-CCTCACGGAACCACGAAC-3’，S：5’-CCGCACTGTCATTCACCA- 3’；TβRⅡ(387bp)A：5’-TGTCCCAGAGCACCAGAG- 3’，S：5’-ACGCCAAGGGCAACTTAC-3’。Trizol抽提总RNA，方法按照试剂说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA浓度为1.8。逆转录扩增按试剂盒说明书操作，PCR循环参数为94℃ 2 min预变性，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min循环30次，72℃延伸7 min，4℃保存。取10 μL RT-PCR产物，1.5%含0.5×TBE的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，用Quantity One软件进行光密度分析。
1.5统计学处理
统计结果用SPSS l0.0软件包处理，所有数据以均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验，统计前均对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验，取α＝0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1NF-κB表达的核转移
阴性对照组NF-κB表达大多已转位于细胞核；阳性对照组NF-κB表达部分位于细胞浆，部分转移至细胞核；TMP组NF-κB表达较少，并主要位于细胞浆，很少发生核转移，见图1。
2.2TMP对HSC中TGF-β1 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，TMP组、阳性对照组TGF-β1 mRNA相对表达量均有显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 50 mg/L 、200 mg/L 浓度组差异无显著性(P>0.05)，TMP 800 mg/L 浓度组TGF-β1mRNA相对表达量显著降低，差异有显著性(P<0.01)(见表1)。
2.3 TMP对HSC中TβRⅠmRNA表达的影响
与阴性对照组相比， TMP 200 mg/L、800 mg/L组TβRⅠmRNA相对表达量降低，其差异有显著性(P<0.05或P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L组TβRⅠmRNA表达量有显著性差异(P<0.01)(见表1)。
2.4TMP对HSC中TβRⅡmRNA表达的影响
与阴性对照组相比，阳性对照组TβRⅡmRNA表达量显著降低(P<0.01)，TMP 200 mg/L、TMP 800 mg/L浓度组的TβRⅡmRNA相对表达量均有显著性差异(P<0.01)；与阳性对照组相比，TMP 200 mg/L 浓度组无显著性差异(P>0.05)，TMP 200 mg/L 、800 mg/L 浓度组TβRⅡmRNA表达量有显著性差异(P<0.05或P<0.01)(见表1)。
图1 HSC NF-κB的表达(sp染色 ×400)
A为阴性对照组NF-κB大量表达，细胞核及细胞浆匀有深棕黄色染色。B为阳性对照组NF-κB表达减少，细胞核及细胞浆染色变浅呈黄色。C为TMP组NF-κB几乎无核表达，细胞浆染色呈淡黄色。
表 1TMP对HSC中TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体mRNA表达的影响 (x±S)
与阴性对照组相比ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与阳性对照组相比* P<0.05，** P<0.01
3讨论
近年来研究发现，HSC是肝纤维化过程中的主要效应细胞[5]。正常生理条件下HSC呈静息状态,储存和代谢维生素A，较紧缩，产生少量的Ⅲ型及Ⅳ型胶原。肝脏损伤时，枯否细胞、肝实质细胞、内皮细胞和血小板产生的激活始动因子激活HSC，使之转化为肌成纤维样细胞，表现为脂滴丢失，形态改变，表达多种细胞因子及受体，大量增殖，大量合成ECM，表达α-SMA，具有收缩功能[6]。活化的HSC产生大量间质胶原和其他肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分 ......
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