小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模方法优化

http://www.100md.com 2011年8月15日 王颖芳 王宇亮 姜枫

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     【摘要】 目的：探索急性酒精性肝损伤小鼠动物模型的造模方法。方法：通过三个实验比较不同剂量、不同灌酒方法、不同灌酒时间动物醉酒率、死亡率和血清转氨酶的不同情况。结果：一次灌酒0.28ml/10g体重小鼠可达中度醉酒，醉酒率70%，死亡率40%；采用小间隔分次灌服法后小鼠醉酒率60%，死亡率降为20%；连续灌酒时，较高剂量组第三天开始出现死亡现象并逐渐加重；血清转氨酶上升的高峰在第5天，此后逐渐下降。结论：白酒灌胃法造急性酒精性肝损伤模型时，采用中等剂量、分次灌胃法可降低死亡率，实验时间以5~7天比较适宜。

    【关键词】 急性酒精性肝损伤；小鼠；动物模型

    随着人们对酒精性肝脏损害重视的提高以及相应实验研究的广泛开展，相关动物模型尤其是急性酒精性肝损伤动物模型在实际实验应用中的问题日益突出。我们在参考文献介绍的方法[1]制造急性酒精性肝损伤动物模型的实验中，对造模实际操作时的一些具体问题和检测指标的时间选择等有所比较和认识，现报告如下，以供同仁参考，在造模上少走弯路，节省经费。

    1 实验材料

    1.1 实验动物昆明种小鼠84只，体重24g~27g，合格证号分别为豫医动字第410115号，均由河南省实验动物中心提供。

    1.2 实验试剂ALT试剂盒，迈克公司生产，批号100122；AST试剂盒，迈克公司生产，批号100103。

    1.3 实验仪器雷勃微量移液器，芬兰雷勃集团中国区总部；DZKW型电子恒温水浴锅，余姚市亚星仪器仪表有限公司；752 N型分光光度计，上海第三分析仪器厂。

    2实验方法

    2.1 实验1普通级昆明种小鼠50只，21g~24g，雌雄各半。将50只小鼠按随机排列表分为5组，每组10只，雌雄各半。其中4组分四个剂量级(M1、M2、M3、M4)造急性酒精性肝损伤模型，另外1组设为空白对照。用56度红星二锅头分别按0.24ml/10g、0.26ml/10g、0.28ml/10g、0.30ml/10g体重灌胃小鼠，每日一次，空白组灌服等容白水。

    2.2 实验2普通级昆明种小鼠20只，21g~24g，雌雄各半。将20只小鼠按随机排列表分为2组(M3、M4)，每组10只，雌雄各半。2组均造急性酒精性肝损伤模型，用56度红星二锅头分别按0.14ml/10g、0.15ml/10g体重灌胃小鼠，每日2次，中间间隔1小时。

    2.3 实验3普通级昆明种小鼠20只，21g~24g，雌雄各半。将20只小鼠按随机排列表分为2组(空白组、M3)，每组10只，雌雄各半。1组造急性酒精性肝损伤模型，用56度红星二锅头按0.14ml/10g体重灌胃小鼠，每日2次，中间间隔1小时，另一组做空白对照，灌服等容白开水。

    3实验结果

    3.1 灌酒量与醉酒率、死亡率

    实验1中，每天于第一次灌酒后开始计时观察，记录醉酒动物数，计算醉酒率。将动物四肢向上仰卧于平台，半分钟内不能自行翻过身体者为阳性，反之为阴性。出现翻正反射阳性者视为醉酒，始终不出现翻正反射阳性者以出现共济失调视为醉酒。死亡率为各组死亡动物只数占该组动物总数的百分比。结果见表1。

    表1一次灌服小鼠的醉酒率和死亡率(%)

    3.2灌酒时间与醉酒率、死亡率

    实验1中，随着灌酒天数的增加，各组动物醉酒率变化不很大，但M3、M4两组的死亡情况日益严重，尤其是M4组，动物死亡数目过多。

    3.3 灌酒方式与醉酒率、死亡率

    实验2采用分次灌服的方式，仍观察醉酒情况，计算醉酒率和死亡率。结果见表2。

    表2分次灌服小鼠的醉酒率和死亡率(%)

    3.4 灌酒时间与有关指标

    实验3中，于第1、3、5、7、9天检测血清ALT、AST。禁食不禁水16小时后，小鼠尾部消毒后，剪尾采血，3000转/分离心，分离血清，按四川迈克ALT、AST检测试剂盒说明书操作。结果见表3。

    4讨论

    本实验对制造酒精性肝损伤小鼠动物模型时的基本实验参数进行了摸索和比较，以供需要运用此动物模型进行实验研究的同仁参考。

    4.1 灌酒量关于灌酒量，各文献的报道很不一致。我们在预实验中发现，对于小鼠，一次灌酒量0.26ml/10g体重，可致轻度醉酒，可见共济失调，昏昏欲睡；0.28ml/10g体重，可致中度醉酒，沉睡后在一定时间段内可自行苏醒；0.30ml/10g体重，可致严重醉酒，沉睡时间过长，在一定时间段内不能自行苏醒，甚至最终死亡，已接近中毒剂量。实际工作中可根据实验目的的需要选择合适的剂量。

    4.2 灌酒方法由实验可以看出，一次灌酒量较大时，动物死亡率较高。同时，灌酒量和口服灌胃的用药量之间也存在矛盾。动物的胃容纳量有限，灌服大量酒后，灌药量就受到限制，常常难以用到理想的用药量。为此，我们把灌酒方法稍加改进，一次灌酒量分为两次灌服，中间间隔1小时。从实验结果来看，并不影响动物的醉酒率，但严重醉酒动物的死亡率有了明显改善，有利于保证实验的顺利进行。我们在进行大鼠实验时，就是采用分次灌服的方法，从而降低了死亡率。这种小间隔分次灌服的方法以往的文献中尚未见报道。

    4.3 灌酒时间连续灌酒时，较高剂量组从第3天开始出现死亡情况且逐渐加重，而中低剂量组死亡情况不明显，也没有显示出明显的累积效应。

    4.4 有关检测指标从转氨酶水平来看，有两个变化阶段，前一阶段呈逐渐上升的趋势，后一阶段呈逐渐下降的趋势。从实验结果可以看出，转氨酶上升的高峰在连续灌酒的第5天，此后就逐渐下降，因此，实际工作中要结合实验目的的需要，选择恰当的实验时间 ......

    http://www.100md.com/html/paper/2075-2156/2011/16/03.htm

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