千里追风活络油微生物限度检查方法的验证(2)
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2 结果
2.1 薄膜过滤法回收率测定
用薄膜过滤法测定大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉5个菌株的回收率，结果见表1。由表1可见，用薄膜过滤法的三次平行试验，稀释剂对照组和试验组，5个菌株的三次平行实验回收率均可以达到70%，说明用薄膜过滤法200 mL冲洗液分4次冲洗是可以消除千里追风活络油对细菌、霉菌和酵母菌的抑制作用的。
2.2 控制菌验证结果
对铜绿假单胞菌检查方法的验证中，试验组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板菌落呈灰白色，扁平，无定形，周边有扩散现象，表面湿润，菌落周边有蓝绿色素扩散。阴性对照组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板无菌落生长。上述实验表明试验组检出铜绿假单胞，阴性对照组未检出大肠埃希菌。
对金黄色葡萄球菌检查方法的验证中，实验组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，周边有黄色环，菌落直径约0.7~1mm。阴性对照组培养后可见增菌培养基混浊生长，平板无菌落生长。上述实验表明试验组检出金黄色葡萄球菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。
铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌控制菌检查的方法验证结果表明薄膜过滤法后，试验菌都能生长良好。
表1 千里追风活络油细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定(薄膜过滤法)
菌株试验次数试验组菌液组稀释剂
对照组供试品
对照组稀释剂对照组回收率(%)试验组回收率(%)
大肠埃希菌①768074092.5095.00
②697460081.0893.24
③738970078.6582.02
金黄色葡萄球菌①707653069.7492.11
②6767670100100
③606363010095.24
菌株试验次数试验组菌液组稀释剂
对照组供试品
对照组稀释剂对照组
回收率(%)试验组回收率(%)
枯草芽孢杆菌①728070087.5090.00
②657464086.4987.84
③809160065.9387.91
白色念珠菌①495754094.7485.96
②475350094.3488.68
③556061010091.67
黑曲霉①768072090.0095.00
②617056080.0087.14
③616869010089.71
3 讨论
药品微生物限度检查是非灭菌制剂不可缺少的重要必检项目。检查之前，应对该药品建立细菌、 霉菌及酵母菌计数方法的验证[2]，控制菌检查方法的验证[3]，以确认所采取的方法适合于该药品的微生物限度检查。
本次研究以中国药典2010版微生物限度检查法方法验证作为依据， 将5种阳性对照菌的回收率试验作为评价常规法和薄膜过滤法的客观标准，确定了千里追风活络油的微生物限度检查的方法。结果显示采用常规法，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均<70%；采用薄膜过滤法，供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率试验均>70 %。表明千里追风活络油对细菌、真菌都有较强的抑菌作用，需采用薄膜过滤法。由于千里追风活络油中含有挥发油成分，直接加入pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液产生分层，因此加入聚山梨酯80能使供试液分散均匀；同时研究发现聚山梨酯 80的加入量不宜太大，应以能使油剂乳化的最小量为适。笔者曾对不同的加入量进行了验证 ......
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