松龄血脉康胶囊对自发性高血压大鼠内皮一氧化氮合酶和内皮素表达的影响(1)
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【摘要】目的：探讨松龄血脉康胶囊对自发性高血压大鼠(SHR)血压的影响及对组织中eNOS和ET在mRNA水平的调控。方法：SHR大鼠24只，平衡血压2周后随机分为3组(空白组、中药组、西药组)，每组8只。中药组以松龄血脉康胶囊20mg/(kg·d)灌服；西药组以雷米普利1mg/(kg·d)灌服，空白组给予同体积的生理盐水，连续4周。采用尾动脉无创测压法检测血压，一周一次。用药四周后，腹主动脉取血处死，冰上取肝脏，荧光实时定量PCR技术检测肝脏eNOS和ET mRNA的表达水平。结果：松龄血脉康胶囊给药4周后，可有效抑制血压上升，调控血压使血压有逐渐下降的趋势；显著上调组织中eNOS mRNA的表达，下调组织中ET mRNA的表达。结论：松龄血脉康胶囊能调控组织中eNOS和ET在mRNA水平的表达，参与对血压的调节。
【关键词】松龄血脉康；eNOS；ET
血管内皮功能在心血管系统中起着重要的作用，内皮来源的血管活性物质参与了血压的调节，其中一氧化氮(NO)和内皮素(ET)是两种最具代表性的物质。NO是体内最主要的舒血管物质，主要受内皮一氧化氮合酶(eNOS)的调控。ET具有强烈收缩血管作用。松龄血脉康胶囊是目前用于高血压治疗确有疗效且毒副反应小的中成药。已有研究表明[1]，松龄血脉康能降低血浆中NO和ET含量。但是，松龄血脉康对组织中eNOS和ET在mRNA水平的调控尚未确定。本文研究了松龄血脉康对自发性高血压大鼠(SHR)组织中eNOS与ET mRNA表达的影响。
1 材料
1.1 实验动物：10周龄雄性SHR大鼠，体重(250±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2007-0001)，饲养于室内通风橱内，恒温(22±2)℃，自然昼夜，自由取食及饮水。
1.2 药品和试剂：松龄血脉康胶囊，批号：100513，成都康弘制药有限公司生产；雷米普利(Ramipril，瑞泰)片剂，批号：c0001，赛诺菲安万特制药有限公司生产；实时定量PCR 试剂均购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。
1.3主要仪器：无创鼠尾压测量仪(BP98AWU，日本软隆)；DY89-1实时定量PCR仪-Linegene 9620 (BIOER)；PCR仪-杭州博日科技有限公司TC-96/g/h(b)。
2方法
2.1分组：SHR大鼠24只，平衡血压2周后随机分为3组(空白组、中药组、西药组)，每组8只。各鼠每日相同时间灌胃给药1次，其中中药组以松龄血脉康胶囊20mg/(kg·d)灌服；西药组以雷米普利1mg/(kg·d)灌服，空白组给予同体积的生理盐水，连续4周。
2.2检测指标
2.2.1血压测定：采用尾动脉无创测压法。在干燥、通风、安静的环境中将大鼠置于37℃恒温袋内预热10min，使大鼠尾动脉充分扩张，将传感器套在鼠尾根部，待大鼠短暂躁动停止后，连续测定3次取平均值作为血压。
2.2.2肝脏eNOS、ET mRNA表达量测定。大鼠腹主动脉取血后，取肝脏使用Trizol试剂提取总mRNA，引物序列见表1。
取总RNA1μg，按照说明书进行逆转录合成cDNA。荧光定量PCR反应条件为：95℃，15min；95℃，20sec；57℃，20sec；40个循环，反应体系为20μL。选取15～25个扩增循环数(cycle threshold，Ct)的荧光信号，计算三个平行复孔的扩增效率，计算ΔCt(=Ct目的基因-Ct内参基因)和ΔΔCt(=(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因))，并计算实验组目的基因与对照组目的基因的差异表达量2-ΔΔCt(=实验组目的基因/对照组目的基因)。
2.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，各组间比较采用方差分析进行统计处理。显著性差异水平定为0.05。
3 结果
3.1松龄血脉康对血压的影响空白、中药、西药三组基础血压无差别；用药两周时，中药组和空白组比较血压开始有差异(P<0.05)；用药四周，中药组和空白组有显著差异(P<0.01)。和空白组比较，中药组血压稳定，没有上升。说明中药能有效抑制血压的升高，使血压维持在稳定的水平。用药四周，中药组血压虽然没有明显变化，但整体上有逐渐下降的趋势(见表2)。
表2 收缩压的变化(x±s)
*P<0.05, **P<0.01和空白组比较; #P<0.05, ##P<0.01 和西药组比较.
3.2肝脏eNOS、ET mRNA表达用药四周后，检测肝脏eNOS、ET mRNA表达量。eNOS mRNA的表达量：与空白组比较，中药组和西药组均明显上调，统计学有显著差异(P<0.01)；中药组和西药组无差别。ET mRNA表达量：与空白组比较，中药组和西药组均明显下调，统计学有显著差异(P<0.01)；中药组和西药组无差别。详见图1。
图 1eNOS、ET mRNA表达量
*P<0.05, **P<0.01和空白组比较; #P<0.05, ##P<0.01 和西药组比较.
4 讨论
内皮一氧化氮合酶(eNOS)是影响NO合成和释放、参与血管张力调节的重要生物活性物质。高血压时，内源性NOS抑制物水平升高可竞争性抑制eNOS活性，导致NO合成受阻引起内皮舒张功能不全[2]。
许多实验已证实，高血压时ET升高， ET升高又加重高血压的病理过程[3]。其机制目前认为可能是：(1)通过平滑肌上的ETA受体介导Ca2+内流：ETA受体激活后可通过与G蛋白耦联的细胞信号转导途径导致Ca2+内流收缩血管。(2)可加强其他缩血管物质的升压效应：ET-1可提高单位摩尔Ca2+的收缩效应，可使儿茶酚胺类的升压效应加强。这种效应是由蛋白激酶C参与的细胞内变化。此外，ET-1与AngⅡ在升高血压上具有协同效应。(3)内皮功能失调，NO合成下降：血浆ET-1升高可使内皮功能失调，NO合成下降。Wedgwood等[4]的研究表明ET-1可使NOS基因启动因子的活性下降40% ......
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