巨噬细胞在混合嵌合体诱导异种免疫耐受中作用的实验研究(2)
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参见附件。
CD68是巨噬细胞特异性标志物,本实验用免疫组化方法检查。免疫组化染色采用SP法(Streptavidin-biotin immunoperoxidase method),操作步骤按说明书染色步骤进行。
1.6 嵌合体嵌合率的测定
A、B、C组动物接受60Coγ射线全身照射后行豚鼠BMC移植,经环磷酰胺预处理,在21d、35d取外周血检测嵌合率。取A、B、C组大鼠的外周血离心分离得到单个核细胞,用PBS调整细胞浓度至1×106/100μL;取上述细胞悬液100μL,加入小鼠抗豚鼠MHC Class Ⅱ抗体,混匀,避光、室温、孵育15min;加入3mL PBS缓冲液,混匀,1500rpm离心5min,弃除上清,管底留少许液体(≤100μL);加入1Test PE标记的大鼠抗小鼠IgA二抗,混匀,避光、室温、孵育15min;加入3mL PBS缓冲液,混匀,1500rpm离心5min,弃上清,加入0.5~1mL PBS重悬,6h内上流式细胞仪检测,通过细胞阳性率来检测受体大鼠的外周血中豚鼠细胞比例。
1.7 外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞检测
正常大鼠及实验组BMC移植后21d流式细胞仪检测外周血中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的水平。取受体大鼠外周血100μL,加入带标记的CD3、CD4、CD8抗体,混匀,避光、室温、孵育15~20min后加入A液、B液和C液进行红细胞裂解;加入5倍以上体积PBS缓冲液,混匀,1500rpm离心5min,弃除上清,管底留少许液体(≤100μL);加入0.5~1mL PBS重悬,流式细胞仪检测。
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