牛晓霞 曹 艳 吴美英

    北京三元基因工程有限公司，北京 102600

    重组人干扰素α1b层析工艺中内毒素的去除

    牛晓霞 曹 艳 吴美英▲

    北京三元基因工程有限公司，北京 102600

    目的通过检测评价重组人干扰素α1b各步层析工艺中内毒素的去除情况，为工艺验证提供参考。方法重组人干扰素α1b层析工艺采用DEAE Sepharose FF离子交换层析、单抗Sepharose-4B亲和层析和Sephacry-S100凝胶过滤层析。采用鲎试剂法检测层析各阶段产物中的内毒素含量，计算内毒素去除率。结果每步层析均有去除内毒素的作用，以亲和层析去除内毒素作用最强。最终所得蛋白的内毒素含量降至0.7EU/1mg以下，总去除率达到99.9999%。结论生产重组人干扰素α1b所用分离纯化层析技术在纯化蛋白的同时能有效去除产品中的内毒素，所得最终产品的内毒素含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。

    重组人干扰素α1b；柱层析；内毒素；去除

    细菌内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的特有结构，其化学成分主要是脂多糖(LPS)，只有当细胞死亡溶解或用人工方法破坏菌体细胞后才释放出来[1-2]，所以叫做内毒素，又称之为热原。LPS具有极强的热原性，少量LPS(2ng/kg)经脉注射就可以引起发烧，大剂量的可以引起血液循环障碍和LPS休克症[3]。因此，非胃肠道给药制剂中内毒素的去除一直是一项重要的任务。

    研究发现，LPS的一端是亲水的特异性多糖区，另一端是疏水的类脂A区，结构上类似表面活性剂。自然条件下，内毒素一般以聚合体形式存在，在亲水环境中还可以形成双层脂膜或脂囊。内毒素的磷酸集团和二价金属离子螯合，可进一步稳定内毒素分子间的聚合，形成更大的内毒素复合体，分子量可由几千到数千万不等[4]。正是由于这种性质的不均一性，生产者们难以找到一个简单的或者通用的内毒素去除方法。水溶液中去除内毒素的方法通常有超滤、活性炭吸附、化学降解和柱层析法等[5-6]，各有优缺点，由于内毒素来源和工艺的多样性，在重组蛋白的内毒素去除时常采用多个工艺过程的结合。

    重 组 人 干 扰 素α1b(recombination human interferon α1b，IFN-α1b)[7]基因工程蛋白采用大肠埃希菌作为表达系统进行发酵生产，在纯化前必须通过高压匀浆、超生破碎等方法将工程菌破壁，以释放蛋白。同时，细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中 ......