1.3.5免疫组织化学染色 HE染色的切片脱色后进行免疫组织化学染色，分析各型ENs中的细胞死亡相关因子。脱蜡进行HE染色的切片，在显微照片(×400)中记录ROIs区ENs的形态学特征。然后用1%盐酸和80%酒精处理脱去HE染色，进行免疫组织化学染色。

    1.3.5.1钙染色 脱去HE染色的切片浸入茜素红处理10min，使蓄积的钙显色。

    1.3.5.2 TUNEL染色 用于检测DNA断裂。脱去HE染色的切片用细胞凋亡原位检测试剂盒进行TUNEL染色。切片在蛋白消化酶液中孵育5min，37℃，PBS冲洗，加TdT反应液孵育10min，37℃，PBS冲洗。再滴加3%H₂O₂室温5min，灭活内源性过氧化物酶。然后加过氧化物酶结合的抗体液，10min，37℃，PBS冲洗，再滴加DAB液室温5min。

    未进行HE染色与脱去HE染色的切片作对照以控制HE染色及脱色对免疫组织化学染色的影响。部分切片不加TdT酶进行温箱孵育，作为阴性对照。

    1.3.6免疫染色细胞阳性率 通过比较相同ROIs区的HE染色与HE染色脱色后进行免疫组织化学染色的显微照片得到各型ENs免疫染色阳性的百分数，将其分为四种级别：76%～100%为(+++)、51%～75%为(++)、26%～50%为(+)、≤25%为(-)。

    1.3.7透射电镜切片制备 假手术组和脑缺血组动物(每组4只)用4%多聚甲醛加5%戊二醛的0.1mol/L的PBS灌注取脑 ......