谭 劲 岳金宝 罗玉姣 吴 丹 刘 寻 李 群

    1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学研究生院，湖南长沙 410208

    口腔黏膜下纤维化是一种以胶原蛋白等细胞外基质异常增多和过渡沉积为主要病变特征的慢性、隐匿性疾病[1]。研究发现中药丹玄口康能影响TGFβ1的表达从而抑制ANE诱导的口腔黏膜成纤维细胞胶原蛋白的分泌[2]，TGFβ1调节胶原等细胞外基质的信号传递，主要由Smad家族蛋白分子来完成[3]。Smad2/3的磷酸化是Smad通路激活的最重要一步，P-Smad2/3由细胞质转入细胞核是信号通路的标志。本研究以体外培养的口腔黏膜成纤维细胞(fibroblast，FB)为研究对象，采用特异性TGF-β受体抑制剂LY2109761[4]阻断TGF-β/Smad通路，运用免疫组化、分子生物学等方法，观察ANE对口腔黏膜成纤维细胞表达胶原蛋白的影响及丹玄口康的干预作用，旨在为OSF的中医药临床治疗提供新的实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 口腔黏膜成纤维细胞(FB)

    口腔黏膜成纤维细胞来自雄性SD大鼠(SPF级，体重220～250g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK (湘)：20U-0005。饲养环境温度25℃，相对湿度50%，自由饮食进水，分笼喂养)，细胞分为4组：正常组、对照组、LY2109761组和丹玄口康组。

    1.2 实验药物

    1.2.1丹玄口康片 湖南中医药大学第一附属医院药剂科生产，由丹参、当归、红花、生地、玄参、白花蛇舌草、生黄芪、薄荷等药组成，院制批号：20140208，规格：每片含生药1g(相当于原药材20g)。

    1.2.2槟榔提取物(ANE) 食用槟榔150g，60℃烤箱烘干碾成粉，加乙醚500mL，10%氨水100mL，充分混合，强震荡，静置24h，4℃。抽滤去渣后，水浴馏去乙醚及氨，浓缩成膏状，60℃烤箱拷干成粉末状，粉溶于蒸馏水，浓度10mg/mL，用0.22μm过滤器过滤除菌后分装，4℃保存备用。

    1.3 主要试剂和设备

    DMEM(高糖型)培养基；胎牛血清；10×多聚赖氨酸(北京索莱宝科技有限公司)；LY2109761(selleck)；兔 抗 Collagen I(Abcam)；小 鼠 抗p-Smad2/3(Abcam)；羊抗兔 IgG(美 Vector)；羊抗小鼠IgG(Vector)；ABC试剂盒；琼脂糖；逆转录试剂盒(北京康为世纪)；EDTA(Sigma)；Tris(Sigma)；Trizol(Invitrogen)；Taq酶(Genstar)；引物(南 京 金 斯 瑞)；DEPC(Sigma)；DL2000 DNA Marker(Genstar)；dNTP(Genstar)；E.B.(Sigma)；SYBGREEN PCR Mix(Invitrogen)；CO2细胞培养箱(南京皓海仪器仪表有限公司)；超净工作台(苏州智净净化设备有限公司)；倒置显微镜(上海赖氏电子科技有限公司)；TGL-18R台式冷冻离心机(eppendorf)；荧光定量 RCP仪(Thermo)；荧光PCR板(Thermo)；164-5050电泳仪(Bio-rad)；水平琼脂糖电泳槽(北京六一)；电动玻璃匀浆器(新芝) ......