赖满香 冯 娟 陈 侠 徐 哲 许意平

    广东食品药品职业学院，广东广州 510520

    南药巴戟天味甘、辛，性微温；归肾、肝经；具有补肾阳、强筋骨，祛风湿之功效；可用于治疗阳痿，不孕，月经失调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软等症[1]。现代研究表明巴戟天具有强壮骨骼、调节免疫、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种药理作用[2-6]。有文献报道[7-9]，巴戟天多糖(morindae officinalis polysaccharide，MOP)为巴戟天抗骨质疏松的有效成分，其具有提高成骨细胞(osteoblasts，OB)的增殖和碱性磷酸酶活性。基于OB来源于骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)， 我们考虑MOP对 BMSCs分化成OB的某些阶段可能会有影响。基于此假设，本实验观察MOP体外对SD大鼠BMSCs增殖及骨向分化的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    3月龄 SD 雌性大鼠，SPF级，体重240g(由暨南大学实验动物中心提供)；低糖DMEM培养基(佳研生物科技有限公司)；胎牛血清(奥地利PAA公司)；CCK-8(日本同仁)；ALP测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；巴戟天多糖(陕西斯诺特生物技术有限公司)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 BMSCs 细胞的获取 采用全骨髓贴壁法[10]，取3月龄 SD 雌性大鼠1只，脱臼处死，无菌条件下取出大鼠股骨，用PBS液反复冲洗骨髓腔，收集混合液，1500r/min，离心4min。在离心后的细胞中加入含有15%胎牛血清的低糖DMEM培养液并反复吹打，然后以1×106个/mL的密度将细胞接种到25cm2塑料培养瓶中，置于培养箱中培养，待细胞铺满瓶底约80%即可传代，同时观察细胞的生长形态变化。用流式细胞仪检测细胞表面标记抗原CD29、CD44、CD45和CD34的表达，以鉴定是否为BMSCs。

    1.2.2 MOP对BMSCs 增殖及成骨分化的影响 取生长良好的第三代BMSCs，以1×104个/mL的密度接种于96孔培养板，培养24h后添加对照组(不加药组)、MOP(高、中、低剂量)组培养液。用CCK-8法分别检测各组干预 1、3、5、7、9、11d BMSCs的 OD值，用PNPP法检测经各组干预14d的 ALP 含量以确定MOP促BMSCs向OB分化的最佳剂量并用于后续实验。后续实验分为MOP组，空白组(未加药的细胞组)，成骨诱导组(添加成骨诱导液的细胞组) ......