王昱嘉 陈德盛 袁如意 钟永浩 刘晓宇

    深圳大学过敏反应与免疫学研究所，广东深圳 518060

    腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)属于粉螨科(Acaridae)，食酪螨属(Tyrophagus)[1]。其是常见的储藏物滋生螨，其尸体、皮壳、代谢产物和排泄物等会污染储存的食品[2]。人在接触、吸入甚至食用其滋生物后，可能会受到腐食酪螨的侵袭，引发人体螨病[3-4]。研究报道，腐食酪螨作为一种过敏原，能够引发遗传体质者发生由IgE介导产生的过敏反应，引起Ⅰ型变态反应性疾病[5]，如皮炎、过敏性鼻炎和过敏性哮喘等[6]。腐食酪螨分布广泛，对人类的正常生活和健康造成严重的影响，是继屋尘螨、粉尘螨后又一重要致敏螨种[7]。过敏原Tyr p 34(原名为Tyr p 24)由IgE筛选克隆取得，其含有153个氨基酸，相对分子质量为17.7 kDa。本实验对Tyr p 34重组蛋白进行克隆、表达、纯化，并对其进行过敏原鉴定，这将有助于腐食酪螨过敏性疾病患者的特异性诊治，具有重要的临床意义。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌种与表达载体 大肠杆菌Rosetta(DE3)与表达载体pET-28a为本实验室构建并保存，能够有效结合并表达腐食酪螨重组蛋白Tyr p 34。

    1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH I和Xho I(生工生物工程股份有限公司)；RNA提取试剂(QIAGEN，奥格生物技术有限公司)，反转录试剂盒(生工生物工程股份有限公司)；Ni-NTA resin及柱子(Amersham Pharmacia公司)。Western blot所用血清采集自深圳市罗湖区人民医院，经过敏原测试诊断为腐食酪螨过敏患者。血清采集均获得患者知情同意，所有血样标本的获取均得到医院医学伦理委员会的认可。

    1.2 方法

    1.2.1 腐食酪螨RNA的提取 选取实验室培养的活腐食酪螨，在液氮中浸泡、研磨，使用RNA提取试剂盒提取其总RNA。

    1.2.2 扩增Tyr p 34基因 以提取的腐食酪螨的总RNA为反转录模板进行反转录，得到腐食酪螨的全部cDNA。根据已知Tyr p 34序列设计特异性引物，上下游引物分别为5’-GACCTTCGAGGAGAACGACC-3’；5’-TGGTAGGCAGGTTGGTAGGT-3’ ......