独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞线粒体凋亡通路的影响(2)
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2.1.5 Annexin V-FITC/PI染色流式检测含药血清干预后退变软骨细胞凋亡情况 根据2.1.3中确定的含药血清最佳干预条件干预各组退变软骨细胞后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，置入
1 000 r·min-1离心机离心5 min，收集细胞沉淀。4 ℃ 1×PBS缓冲液重悬细胞，置1 000 r·min-1离心机离心5 min，收集细胞沉淀，用试剂盒内的缓冲液重悬细胞，调整其浓度为1×106·mL -1。按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL FITC和5 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min，之后每管再加400 μL 1×PBS缓冲液。上机检测、分析软骨细胞的凋亡率。
2.1.6 JC-1染色流式检测含药血清干预后退变软骨细胞线粒体膜电位的改变 根据2.1.3中确定的含药血清最佳干预条件干预退变软骨细胞完毕后，胰酶消化收集细胞，重悬、计数，每份样本取3×106个细胞，PBS洗涤1次。用500 μL JC-1工作液(10 μg·mL-1)将收集好的细胞重悬，充分混匀，置于37 ℃细胞培养箱中孵育20 min；孵育结束后，于2 000 r·min-1离心机离心5 min，吸除上清，PBS洗涤2次。500 μL PBS重悬细胞，转移至流式管，上机检测。
2.1.7 分光光度法检测含药血清干预后退变软骨细胞中caspase-9和caspase-3活性 根据2.1.3中确定的含药血清最佳干预条件干预退变软骨细胞后，吸净上清液，加入50 μL预冷的细胞裂解液(Cell Lysis Buffer)，置冰上孵育10 min ......
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