50 μL质量分数为3%的H2O2反应20 min，再次冲洗后经质量分数为5%的BSA封闭30 min，阳性对照组加入含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反应过夜，阴性对照组加入PBS作为对照，后经PBS冲洗3遍

    后加入50 μL二抗(1∶200)反应30 min，再次冲洗后以每张玻片50 μL DAB浸润10 min，再依次经过漂洗、苏木素复染、冲洗(PBS)、返蓝2 s、常温晾干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与透明后封片与观察[6]。

    2.3 实验分组 本实验使用第2代软骨细胞，经鉴定后共分6组，分别为正常组，模型组，DKK-1抑制剂组，以及独活寄生汤水提物低、中、高剂量组。除正常组外，其余各组均经10 ng·mL-1浓度IL-1β造模，造模成功后，DKK-1抑制剂组加入

    5 μg·mL-1浓度的DKK-1，独活寄生汤水提物低、中、高剂量组分别加入100，200，400 μg·mL-1的独活寄生汤水提物。

    2.4 RT-PCR法检测Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA

    2.4.1 Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA引物设计与合成

    2.4.2 RT-PCR方法 采用Trizol法进行Total RNA提取 ......