2.4 Western Blot 检测软骨下骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表达 取出待检各组大鼠软骨下骨组织，提取各组总蛋白，BCA法进行蛋白定量，精确添加相关试剂。首先配制体积分数为12%的下层胶(分离胶)，利用蒸馏水重力施压胶面确保同水平面后，待其凝固后吸净上层蒸馏水;再配制体积分数为5%的上层胶(浓缩胶)予以灌板，同时迅速插入梳子，待其完全凝固拔出梳子备用;然后以每孔20 μg进行上样，后依次经电泳(前10 min调至20 V电压，后于50 V电压下运行30 min，然后设置100 V电压跑至胶底)、转膜(电流为1.3 A、电压25 V)、封闭;再将各条膜放入提前配制完毕的Wnt4(1 μg·mL-1)、GSK-3β(1∶5000)、β-catenin (1∶4000)、β-actin(1∶1000)待检指标的一抗反应袋中，转移至低温环境(4 ℃)，在振荡摇床匀速作用下，反应过夜，进行充分一抗孵育;后转移至二抗(羊抗兔，浓度为1∶5000)反应袋中，使其发生抗体结合反应，标记并扩大一抗信号;后将各条待检膜带置于高敏ECL显影液中反应，经曝光成像(凝胶成像仪)，得出数据进行保存、分析 ......