王雄将，梁英业，卢栋明，唐宏亮，夏 天*

    (1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；3.防城港市中医医院，广西 防城港 538000)

    神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由于躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛[1]，因其常引起自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉异常等[2]，传统药物难以彻底消除疼痛，且长期口服药物容易产生各种不良反应[3-4]。推拿产生的刺激由神经传导[5]，本课题组前期研究证实推拿具有较好的镇痛效果，推拿组大鼠经10 d 推拿干预后，细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)水平明显低于L5 脊神经结扎(SNL)造模组，表明推拿可以下调ERK的水平[6-7]。另有研究发现，疼痛的发生和传递可由脊髓背角的ERK通路调控，一旦ERK信号通路被抑制，脊髓背角神经元内囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporters，VGLUTs)的表达水平也明显下降[8-9]。谷氨酸(Glu)作为一种兴奋性神经递质，可以感知、传导和调控外周疼痛信息，与神经病理性疼痛密切相关，VGLUTs 作为Glu 转运体参与Glu 能神经传递过程，与疼痛密切相关[10]；目前已知VGLUTs2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)表达更为活跃，可通过介导谷氨酸的释放来参与疼痛传导[11-13]。本实验研究枢经推拿对SNL大鼠脊髓背角VGLUT2的影响，为探讨推拿的镇痛机制提供实验依据。

    1 实验材料

    1.1 动物 SPF 级SD 大鼠72 只，雄性，体质量250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004；使用许可证：SYXK(桂)2019-0001。饲养环境：单笼喂养，温度为20～25 ℃，光照时间：8:00～20:00；空气湿度：35%～45%。予自由饮用自来水，饲用普通清洁鼠饲料，保持环境清洁。适应性饲养7 d后进行实验。

    1.2 试剂 兔抗鼠VGLUT2(批号：ab217943，英国Abcam)；兔抗p-actin(批号：ab209857，1∶1 000，英国Abcam)；慢病毒HBLV-r-Slc17a6 shRNA1-GFP-PURO[汉恒生物科技(上海)有限公司]。

    1.3 仪器 热板痛觉测试仪(型号：Hot Plate Analgesia test；美国IITC Life Science)；von Frey 纤维丝(美国Stoelting)；二氧化碳恒温孵育箱(型号：Form311；美国Forma)；组织包埋机(型号：HistoStar；美国Thermo)；石蜡切片机(型号：RM2135；德国Leica)；酶标仪(型号：1691130A；美国Bio-Rad)；ImageQuant LAS 4000mini凝胶成像系统(型号：ImageQuant LAS 4000mini ......