钱康琦，孙玉明*，詹秀琴

    (1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029;2.南京中医药大学基础医学院,江苏 南京210046)

    骨骼系统的发育异常导致许多疾病，如骨质疏松、骨关节炎、风湿性关节炎等。骨质疏松症是以骨量减少，骨组织的显微结构发生改变，并伴随骨质脆性增加和骨折危险性升高的一类全身性骨骼疾病。以往的研究[1-2]证实了葛根素具有改善骨质疏松的作用，促进成骨细胞分化。近年来,随着分子生物学技术发展，Smads蛋白家族中的Smad 2/3信号蛋白受到越来越多的关注，而且此类研究尚不多见，因此，从这条信号转导途径研究骨质疏松症的发病机理是一个新的切入点。本实验拟采用成骨细胞体外培养的方法，探讨葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3蛋白表达的影响。在分子生物学层面，通过蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法进一步研究观察TGF-β1/Smad信号通路在葛根素防治骨质疏松症的机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物 SPF级，新生24 h小鼠, 均由浙江省动物实验中心提供。动物合格证：SCXK(浙)2008-0033。

    1.1.2 药物 葛根素:购自中国药品生物制品检定所，批号：110752-200912，20 mg/支，纯度为96.0%，性状为白色粉末，干燥密闭保存。

    1.1.3 主要试剂 胎牛血清(GIBCO，USA)，DMEM培养基(Hyclone)，含EDTA的0.25%胰蛋白酶(WISENT BIOCENTER)，磷酸盐缓冲液(PBS)及Ⅱ型胶原酶(Gibco)，四唑盐MTT(Amresco)，二甲基亚砜DMSO(Sigma)，内参一抗(rabbit β-Actin)(Immunoway)，内参二抗(IgG-HRP)(Jackson)，全蛋白抽提试剂盒，5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，10×电转移缓冲液，WB抗体清除缓冲液，WB封闭液，显色液，定影液。

    1.1.4 主要仪器 高速冷冻离心机(Sigma) ......