房军帆，杜俊英，梁 宜，方剑乔

    (浙江中医药大学，杭州310053)

    非放射性EMSA法检测AP-1蛋白DNA结合活性实验优化

    房军帆，杜俊英，梁 宜，方剑乔*

    (浙江中医药大学，杭州310053)

    目的 探索一种方案简便，仪器要求较低，且有效的非放射性凝胶电泳迁移率(EMSA)的检测方法。方法 以AP-1蛋白为实验对象，自制退火缓冲液合成生物素标记AP-1探针，抽提炎症大鼠脊髓背角处核蛋白(无需纯化)，取10 μg核蛋白与探针室温反应30 min。小型聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳后将探针湿转至正电子加强尼龙膜上，紫外交联，ECL显影。通过正常探针与变性探针的竞争实验，证明方法的可靠性。结果 自制退火缓冲液成功合成生物素标记AP-1探针;炎症大鼠脊髓背角处AP-1蛋白与正常探针的结合后产生明显滞后条带，且结合力远高于变异探针。结论 优化后的非放射性EMSA方案，有效降低了实验花费和仪器要求，且结果可信。

    凝胶电泳迁移率(EMSA);AP-1;凝胶电泳;实验优化

    凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，又称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测，是一种用于研究转录因子和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的DNA结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。该实验技术操作较为复杂，不少学者[1-2]从不同的角度对该技术的优化改进进行了探讨。但这些讨论大多针对放射性EMSA技术。对非放射性EMSA技术的讨论现尚少见。AP-1是最常见的转录因子之一，参与多种基因转录的调控[3]。本实验室立足自身条件，建立了一种简单、实用的非放射性EMSA实验方法，现以AP-1蛋白的DNA结合活性检测为例，介绍如下。

    1 材料

    1.1 实验试剂 EDTA、Hepes(美国SIGMA公司)，Poly(dI·dC)(美国Thermo公司)，细胞核和细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天)，BCA法蛋白定量试剂盒(碧云天)，其余试剂均为市售分析纯级。

    1.2 主要仪器 垂直电泳槽和电泳仪(美国BIO RAD公司)，紫外分光光度计(美国BIO RAD公司)，Image LAS4000凝胶成像分析系统(美国GE公司)。

    1.3 寡核甘酸单链 上海生物工程公司订购生物素标记的AP-1探针寡核甘酸单链(AP-1)和突变AP-1探针寡核苷酸单链(AP-1m)，未标记的AP-1探针寡核甘酸单链和突变AP-1探针寡核苷酸单 ......