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    (1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，长春 130021；2.延边大学医学院，吉林 延吉 133000)

    ·现代医学研究·

    pcDNA-DEST47-miR-29b重组质粒的构建及其对VEGF表达的靶向调控作用

    单鸿阁1,2，高辉1，张海芹1，董娟聪1，金顺子1*

    (1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，长春 130021；2.延边大学医学院，吉林 延吉 133000)

    目的 构建has-miR-29b重组表达载体,并探讨其对VEGF表达的靶向调控作用。方法 利用生物信息学方法预测has-miR-29b与VEGF-3′UTR的结合位点;将PCR扩增的miR-29b前体序列和pcDNA-DEST47载体经酶切后连接，构建pcDNA-DEST47-miR-29b表达载体；采用荧光素酶检测法和Western blot法证实miR-29b对VEGF蛋白表达的抑制作用。结果 psiCHECK2-VEGF荧光素酶报告质粒和pcDNA-DEST47-miR-29b两种质粒共转染组的荧光素酶活性明显低于单独转染的空载体组和Lu-VEGF组(P1 材料与方法

    1.1 细胞培养与转染 Jurkat细胞由本实验室保存,RPMI-1640培养液中加入含10%胎牛血清，置37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。用500 μL灭菌水稀释4 μg重组质粒并加入10 μL脂质体，室温放置20 min制成DNA-脂质体溶液。将DNA-脂质体溶液加入已换成无血清培养基的Jurkat细胞中，继续培养6 h后更换完全培养基。

    1.2 重组真核表达载体的构建和鉴定 1)生物信息学预测miR-29b与VEGF-3′UTR结合位点采用常见的靶标基因预测软件Targetscan及RNAhybrid预测miR-29b与VEGF的3′UTR结合位点。在线预测网站分别为http://www.microrna.org和http://microrna.sanger.ac.uk。

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