大鼠血清外泌体对MCF—7细胞自噬的影响(1)
【摘要】目的 观察SD大鼠血清外泌体对乳腺癌(MCF-7)细胞自噬的影响。方法 将MCF-7细胞分为正常对照组、雷帕霉素组、外泌体组及联合给药组，外泌体组为加入10%(v/v)外泌体培养48 h，雷帕霉素组为加入雷帕霉素(30 nM)作用24 h，联合给药组为加入10%(v/v)外泌體培养48 h后，再加入雷帕霉素(30 nM)作用24 h，正常对照组仅使用10% DMEM培养基培养48 h。采用CCK-8法检测各组乳腺癌细胞的存活率；荧光显微镜观察MCF-7细胞LC3B蛋白的荧光强度；Western blotting法检测MCF-7细胞LC3B。结果 4组细胞的存活率无显著性差异，MCF-7细胞LC3B2/LC3B1比值分别为1.317±0.430、2.308±1.085、0.808±0.350、1.110±0.496。外泌体组与雷帕霉素组有显著性差异；联合给药组与雷帕霉素组也有显著性差异。结论 大鼠血清外泌体能减少MCF-7细胞的自噬现象。
【关键词】外泌体；MCF-7细胞；细胞自噬
【中图分类号】R737.9 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.07..02
1963年，比利时的细胞学家克里斯汀德迪夫率先提出了一个术语“自噬”，即一种由细胞自身调控的毁灭机制，用来降解无用或功能失调的组份[1]。大隅良典于90年代阐明了细胞自噬的机制，研究者们直至此时才发现自噬在人体中的重要作用[2]。外泌体是一种细胞来源的囊泡，存在于许多乃至所有真核生物的体液中，包括血液、尿液以及细胞培养的培养液中[3-4]。几乎所有类型的细胞都通过自噬克服饥饿、回收养分以及将多余的或有害的成分转运至细胞外。同时外泌体能够在细胞间传递，因此在某些情况下这一转运过程是通过外泌体进行的[5]。目前关于血清外泌体的研究大多集中于作为新的生物标志物用于活体检验方面，对于血清外泌体与肿瘤及自噬之间的研究较少。本研究观察了大鼠正常血清外泌体对乳腺癌(MCF-7)细胞自噬的影响。
1 材料与方法
1.1 药物、试剂及仪器
人乳腺癌细胞株MCF-7；高糖DMEM培养基；四季青胎牛血清；胰岛素(Sigma公司)；胰酶；雷帕霉素(Rapamycin)；CCK-8试剂盒、LC3B抗体、GAPDH抗体、鼠抗、兔抗(碧云天公司)；脱脂奶粉
1.2 细胞培养及血清外泌体提取及鉴定
MCF-7细胞用DMEM培养液(含10 %胎牛血清、0.01 mg/ml胰岛素)培养。培养条件为37℃、5%CO2。
取1 ml正常SD大鼠血清，试剂盒法提取，用PBS重悬至
200 μl，加入DMEM(含10%FBS)培养液，配置成每100 μl培养液含10 μl外泌体，0.22 μm微孔滤膜过滤。对所提取的血清外泌体采用透射电镜检测其形态特征，采用WB法鉴定特征性蛋白质。
1.3 血清外泌体对MCF-7细胞存活率的影响观察
取对数生长期的MCF-7细胞，PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化，按4×104个/孔接种于96孔细胞培养板，分为Control、雷帕霉素(Rapa)、外泌体(Exo)、Exo+Rapa组，每组设3个平行复孔。Control组不加任何药物培养；Rapa组加入30nM Rapa，作用24 h；Exo组加入过滤后的含10%外泌体的培养液，培养48 h；Exo+Rapa组先加入含10%外泌体的培养液，培养48 h，然后加入30 nM Rapa，作用
24 h。处理结束后使用CCK-8试剂盒，孵育1 h，检测450 nm波长处的吸光度(OD)。取3孔OD值的平均值。
1.4 MCF-7细胞LC3B的荧光检测
细胞分组同1.3。吸弃培养基，PBS洗3次，固定
15 min。去除固定液，洗涤后加入封闭液，37℃下封闭
1 h。加入LC3B抗体(1：100)4℃孵育过夜，移除抗体洗涤后加入绿色DyLight 488荧光二抗，37℃孵育1 h，洗涤后加入DAPI染核，加入抗荧光淬灭剂，封片。用荧光显微镜观察，在相同曝光时间下拍照。
1.5 MCF-7细胞LC3B蛋白检测
细胞分组同1.3。采用Western blotting法，提取MCF-7细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳后转膜2 h，5%奶粉室温封闭2 h，TBS/T洗涤后加入一抗(LC3B，1：1000；GAPDH，1：1000)4℃孵育过夜。洗涤后加入相应二抗，37℃孵育1 h。使用ECL进行显影，用Image J分析软件定量分析目的条带的灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS统计分析软件。计量资料以“x±s”表示，行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 血清外泌体的分离鉴定
血清外泌体在透射电镜下呈茶托样、双分子层结构。Western blotting法结果显示，试剂盒提取的血清外泌体具有标志性的CD63及HSP70蛋白。
2.2 MCF-7细胞存活率的比较
Control、Rapa、Exo及Exo+Rapa组的OD值分别为0.367±0.043、0.345±0.031、0.650±0.051、0.420±0.020。结果显示，雷帕霉素对MCF-7细胞的生长有一定影响，但抑制作用并不明显，血清外泌体则明显促进MCF-7细胞的增殖。
2.3 MCF-7细胞LC3B表达的荧光结果比较
如图1所示，颗粒状绿色荧光为自噬标志性蛋白LC3B。Control组中，MCF-7细胞有少量的自噬现象；Rapa组中，由于加入自噬诱导剂，细胞的自噬显著增多；而Exo组的细胞自噬现象与正常对照组相比更少，几乎无自噬现象；至于Exo+Rapa组的细胞则与Control组相类似。, 百拇医药(陈奇 徐彬 毛建文)
【关键词】外泌体；MCF-7细胞；细胞自噬
【中图分类号】R737.9 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.07..02
1963年，比利时的细胞学家克里斯汀德迪夫率先提出了一个术语“自噬”，即一种由细胞自身调控的毁灭机制，用来降解无用或功能失调的组份[1]。大隅良典于90年代阐明了细胞自噬的机制，研究者们直至此时才发现自噬在人体中的重要作用[2]。外泌体是一种细胞来源的囊泡，存在于许多乃至所有真核生物的体液中，包括血液、尿液以及细胞培养的培养液中[3-4]。几乎所有类型的细胞都通过自噬克服饥饿、回收养分以及将多余的或有害的成分转运至细胞外。同时外泌体能够在细胞间传递，因此在某些情况下这一转运过程是通过外泌体进行的[5]。目前关于血清外泌体的研究大多集中于作为新的生物标志物用于活体检验方面，对于血清外泌体与肿瘤及自噬之间的研究较少。本研究观察了大鼠正常血清外泌体对乳腺癌(MCF-7)细胞自噬的影响。
1 材料与方法
1.1 药物、试剂及仪器
人乳腺癌细胞株MCF-7；高糖DMEM培养基；四季青胎牛血清；胰岛素(Sigma公司)；胰酶；雷帕霉素(Rapamycin)；CCK-8试剂盒、LC3B抗体、GAPDH抗体、鼠抗、兔抗(碧云天公司)；脱脂奶粉
1.2 细胞培养及血清外泌体提取及鉴定
MCF-7细胞用DMEM培养液(含10 %胎牛血清、0.01 mg/ml胰岛素)培养。培养条件为37℃、5%CO2。
取1 ml正常SD大鼠血清，试剂盒法提取，用PBS重悬至
200 μl，加入DMEM(含10%FBS)培养液，配置成每100 μl培养液含10 μl外泌体，0.22 μm微孔滤膜过滤。对所提取的血清外泌体采用透射电镜检测其形态特征，采用WB法鉴定特征性蛋白质。
1.3 血清外泌体对MCF-7细胞存活率的影响观察
取对数生长期的MCF-7细胞，PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化，按4×104个/孔接种于96孔细胞培养板，分为Control、雷帕霉素(Rapa)、外泌体(Exo)、Exo+Rapa组，每组设3个平行复孔。Control组不加任何药物培养；Rapa组加入30nM Rapa，作用24 h；Exo组加入过滤后的含10%外泌体的培养液，培养48 h；Exo+Rapa组先加入含10%外泌体的培养液，培养48 h，然后加入30 nM Rapa，作用
24 h。处理结束后使用CCK-8试剂盒，孵育1 h，检测450 nm波长处的吸光度(OD)。取3孔OD值的平均值。
1.4 MCF-7细胞LC3B的荧光检测
细胞分组同1.3。吸弃培养基，PBS洗3次，固定
15 min。去除固定液，洗涤后加入封闭液，37℃下封闭
1 h。加入LC3B抗体(1：100)4℃孵育过夜，移除抗体洗涤后加入绿色DyLight 488荧光二抗，37℃孵育1 h，洗涤后加入DAPI染核，加入抗荧光淬灭剂，封片。用荧光显微镜观察，在相同曝光时间下拍照。
1.5 MCF-7细胞LC3B蛋白检测
细胞分组同1.3。采用Western blotting法，提取MCF-7细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳后转膜2 h，5%奶粉室温封闭2 h，TBS/T洗涤后加入一抗(LC3B，1：1000；GAPDH，1：1000)4℃孵育过夜。洗涤后加入相应二抗，37℃孵育1 h。使用ECL进行显影，用Image J分析软件定量分析目的条带的灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS统计分析软件。计量资料以“x±s”表示，行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 血清外泌体的分离鉴定
血清外泌体在透射电镜下呈茶托样、双分子层结构。Western blotting法结果显示，试剂盒提取的血清外泌体具有标志性的CD63及HSP70蛋白。
2.2 MCF-7细胞存活率的比较
Control、Rapa、Exo及Exo+Rapa组的OD值分别为0.367±0.043、0.345±0.031、0.650±0.051、0.420±0.020。结果显示，雷帕霉素对MCF-7细胞的生长有一定影响，但抑制作用并不明显，血清外泌体则明显促进MCF-7细胞的增殖。
2.3 MCF-7细胞LC3B表达的荧光结果比较
如图1所示，颗粒状绿色荧光为自噬标志性蛋白LC3B。Control组中，MCF-7细胞有少量的自噬现象；Rapa组中，由于加入自噬诱导剂，细胞的自噬显著增多；而Exo组的细胞自噬现象与正常对照组相比更少，几乎无自噬现象；至于Exo+Rapa组的细胞则与Control组相类似。, 百拇医药(陈奇 徐彬 毛建文)