血脂康对OX—LDL诱导巨噬细胞组织因子(TF)表达的影响及相关机制(1)
【摘要】目的 观察血脂康(红曲)对OX-LDL诱导巨噬细胞MDA含量、SOD活性、组织因子表达及P65表达和转位的影响及相关机制。方法 体外培养巨噬细胞RAW264.7，分别加入ox-LDL、ox-LDL+洛伐他汀(10 μmol/ml)、ox-LDL+血脂康(25 μg/ml)、ox-LDL+血脂康(50 μg/ml)和ox-LDL+血脂康
(100 μg/ml)孵育48 h。TBA法和黄嘌呤氧化酶法检测细胞培养上清中的MDA含量和SOD活性。Western blot检测巨噬细胞RAW264.7组织因子(TF)表达水平。免疫荧光法检测巨噬细胞AW264.7 P65表达以及转位。结果 与对照组相比，ox-LDL组SOD活性降低，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位明显增多；与ox-LDL组相比，血脂康组SOD活性显著增加，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位明显减少，并呈剂量依赖性。与洛伐他汀组相比，高剂量组血脂康SOD活性改善作用更显著，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位的抑制作用更明显。结论 血脂康可使RAW264.7的SOD活性增加，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位减少；与洛伐他汀相比，血脂康抑制氧化应激、下调组织因子和抑制P65转位的作用更明显；血脂康比洛伐他汀具有更强的抗动脉粥样硬化作用。
【关键词】血脂康；巨噬细胞RAW264.7；氧化应激；组织因子；P65
【中图分类号】R541.4 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.19..03
巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可导致氧化应激、炎症因子分泌及组织因子(TF)的表达，形成泡沫细胞，在动脉粥硬化性疾病中起着重要作用[1]。血脂康是特制红曲，含有洛伐他汀及其同系物，同时还富含有不饱和脂肪酸、黄酮類物质、麦角甾醇、生物碱等多种生物活性物质[2]。大规模的临床试验中国冠心病二级预防研究(China coronary secondary prevention study CCSPS)证实，血脂康能显著降低冠心病患者非致死性心肌梗死及冠心病死亡的发生率，减少对PCI和(或)CABG的需求，同时减少肿瘤死亡和各种原因的总死亡[3]。与4S、CARE和LIPID 等国外的冠心病二级预防试验相比，CCSPS虽然TC和LDL-C降低的幅度较小，但在降低总死亡率、冠心病事件的发生率以及减少对PCI和CABG需求方面的疗效有明显优势，提示血脂康具有独立于降脂的心血管保护作用[3]。大量的研究表明，血脂康还具有抗炎、抗氧化、保护内皮功能、改善斑块稳定性等心血管保护作用。然而血脂康是否对巨噬细胞MDA含量、SOD活性、组织因子表达及P65表达和转位的影响及相关机制尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与药物
氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)由北京协和医科大学提供；血脂康原粉由北大维信公司提供；洛伐他汀(Sigma公司 美国)；特级胎牛血清(Gibico公司 美国)；MTT试剂盒(南京凯基生物有限公司)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RPMI 1640(Hyclone公司 美国)；0.25%胰蛋白酶(南京凯基生物有限公司)；DMSO(Sigma公司 美国)；FITC标记的兔二抗(Santa Cruz公司)；青霉素、链霉素双抗(南京凯基生物有限公司)；山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)；
TF Rabbit Polyclonal Antibody(Santa Cruz，American)；P65 abbit Polyclonal Antibody(Santa Cruz，American)；β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Santa Cruz，American)。
1.2 细胞株
小鼠巨噬细胞白血病细胞株(RAW264.7)由南京凯基生物有限公司提供。
1.3 仪器
CO2恒温培养箱(日本ESPEC 公司)；IMT212倒置相差显微镜(日本Olympus公司)； BH22型光学显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；细胞培养超净工作台(北京嘉创博远净化科技有限公司)；UNICO2100UV紫外/可见光分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(上海尤尼科仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(北京迈瑞达科技有限
公司)。
Olympus FV 1000激光共聚焦显微镜(日本Olympus 公司)。
1.4 方法
1.4.1 RAW264.7 P65细胞的培养
巨噬细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，24～28 h换培养液一次，48～72 h传代。待巨噬细胞处于对数生长期且形成致密融合单层后分组处理以备实验使用。并使用MTT实验证实各实验组药物对细胞存活率没有影响。
1.4.2 实验分组
实验共分6个组，每组设6个复孔：(1)空白组(control)，RPMI1640培养液(2)ox-LDL组，细胞培养液中加入50 μg/mlox-LDL；(3)洛伐他汀组(L)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL及10 μmol/ml洛伐他汀；(4)血脂康低剂量组(XZK25)，细胞培养液中加入
50 μg/ml ox-LDL 及25 μg/ml血脂康；(5)血脂康中剂量组(XZK50)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL 及50 μg/ml血脂康；(6)血脂康高剂量组(XZK100)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL 及100 μg/ml血脂康。各组均孵育48小时。, 百拇医药(杨亚兵 刘梅林)
(100 μg/ml)孵育48 h。TBA法和黄嘌呤氧化酶法检测细胞培养上清中的MDA含量和SOD活性。Western blot检测巨噬细胞RAW264.7组织因子(TF)表达水平。免疫荧光法检测巨噬细胞AW264.7 P65表达以及转位。结果 与对照组相比，ox-LDL组SOD活性降低，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位明显增多；与ox-LDL组相比，血脂康组SOD活性显著增加，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位明显减少，并呈剂量依赖性。与洛伐他汀组相比，高剂量组血脂康SOD活性改善作用更显著，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位的抑制作用更明显。结论 血脂康可使RAW264.7的SOD活性增加，MDA水平、TF表达及P65细胞核转位减少；与洛伐他汀相比，血脂康抑制氧化应激、下调组织因子和抑制P65转位的作用更明显；血脂康比洛伐他汀具有更强的抗动脉粥样硬化作用。
【关键词】血脂康；巨噬细胞RAW264.7；氧化应激；组织因子；P65
【中图分类号】R541.4 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.19..03
巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可导致氧化应激、炎症因子分泌及组织因子(TF)的表达，形成泡沫细胞，在动脉粥硬化性疾病中起着重要作用[1]。血脂康是特制红曲，含有洛伐他汀及其同系物，同时还富含有不饱和脂肪酸、黄酮類物质、麦角甾醇、生物碱等多种生物活性物质[2]。大规模的临床试验中国冠心病二级预防研究(China coronary secondary prevention study CCSPS)证实，血脂康能显著降低冠心病患者非致死性心肌梗死及冠心病死亡的发生率，减少对PCI和(或)CABG的需求，同时减少肿瘤死亡和各种原因的总死亡[3]。与4S、CARE和LIPID 等国外的冠心病二级预防试验相比，CCSPS虽然TC和LDL-C降低的幅度较小，但在降低总死亡率、冠心病事件的发生率以及减少对PCI和CABG需求方面的疗效有明显优势，提示血脂康具有独立于降脂的心血管保护作用[3]。大量的研究表明，血脂康还具有抗炎、抗氧化、保护内皮功能、改善斑块稳定性等心血管保护作用。然而血脂康是否对巨噬细胞MDA含量、SOD活性、组织因子表达及P65表达和转位的影响及相关机制尚不清楚。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与药物
氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)由北京协和医科大学提供；血脂康原粉由北大维信公司提供；洛伐他汀(Sigma公司 美国)；特级胎牛血清(Gibico公司 美国)；MTT试剂盒(南京凯基生物有限公司)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RPMI 1640(Hyclone公司 美国)；0.25%胰蛋白酶(南京凯基生物有限公司)；DMSO(Sigma公司 美国)；FITC标记的兔二抗(Santa Cruz公司)；青霉素、链霉素双抗(南京凯基生物有限公司)；山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)；
TF Rabbit Polyclonal Antibody(Santa Cruz，American)；P65 abbit Polyclonal Antibody(Santa Cruz，American)；β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Santa Cruz，American)。
1.2 细胞株
小鼠巨噬细胞白血病细胞株(RAW264.7)由南京凯基生物有限公司提供。
1.3 仪器
CO2恒温培养箱(日本ESPEC 公司)；IMT212倒置相差显微镜(日本Olympus公司)； BH22型光学显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；细胞培养超净工作台(北京嘉创博远净化科技有限公司)；UNICO2100UV紫外/可见光分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(上海尤尼科仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(北京迈瑞达科技有限
公司)。
Olympus FV 1000激光共聚焦显微镜(日本Olympus 公司)。
1.4 方法
1.4.1 RAW264.7 P65细胞的培养
巨噬细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，24～28 h换培养液一次，48～72 h传代。待巨噬细胞处于对数生长期且形成致密融合单层后分组处理以备实验使用。并使用MTT实验证实各实验组药物对细胞存活率没有影响。
1.4.2 实验分组
实验共分6个组，每组设6个复孔：(1)空白组(control)，RPMI1640培养液(2)ox-LDL组，细胞培养液中加入50 μg/mlox-LDL；(3)洛伐他汀组(L)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL及10 μmol/ml洛伐他汀；(4)血脂康低剂量组(XZK25)，细胞培养液中加入
50 μg/ml ox-LDL 及25 μg/ml血脂康；(5)血脂康中剂量组(XZK50)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL 及50 μg/ml血脂康；(6)血脂康高剂量组(XZK100)，细胞培养液中加入50 μg/ml ox-LDL 及100 μg/ml血脂康。各组均孵育48小时。, 百拇医药(杨亚兵 刘梅林)