异羟肟酸对宫颈癌细胞生长抑制作用的研究(1)
【中图分类号】R490.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2016)12-0-01
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDI)是一类特异性抑制组蛋白去乙酰化酶、促进染色质解螺旋、增强其趋近性，从而调节基因转录的小分子化合物。体内、外研究证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用，与放射联合还有放射增敏作用[1]。
近来研究表明， 异羟肟酸有组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase ， HDAC)抑制剂活性， 可抑制多种肿瘤细胞生长。异羟肟酸被广泛称为低毒性HDAC抑制剂。Tambunan US[2]等研究提出了利用苯三唑对异羟肟酸修改，获得一个更好的抑制剂。本研究观察异羟肟酸对宫颈癌Hela 和Siha 细胞株生长和细胞周期的影响及p53mRNA 和蛋白表达改变。
1.材料与方法
1.1 材料
异羟肟酸购自Sigma 公司，用PBS 稀释成500mmol/L， 过滤分装，贮藏于- 20℃。P53抗体购自Santa Cruz 公司，为鼠抗人单抗。RPMI-1640 (Gibco 公司)。TRIZOL 试剂购自Invitrogen 公司。新生牛血清(杭州四季青)。FACSort 流式细胞仪为美国Becton Dickson 公司产品。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；AnnexinV-FITC 凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson 公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞和细胞培养
Hela 和Siha 细胞株由本科室保存。细胞在5% CO2、37℃条件下，用含10% 新生牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)的RPMI-1640 培养液培养传代。
1.2.2 MTT 实验检测生长抑制率
取对数生长期宫颈癌细胞，按细胞浓度为5×104/ 孔接种于96 孔板。37℃、5%CO2 饱和湿度培养24h 后， 分别加入不同浓度SAHA(0， 1.2， 2.4， 5.0 mM) 的培养基，每孔200μl，对照组不做处理。分别于加药后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT 溶液(5mg/ml)20μl， 37℃避光培养4h。彻底吸去MTT 溶液，加入二甲基亚砜150μl/孔， 震荡10min， 酶标仪490nm激发波长检测吸光度。计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1- 实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。每次实验设3 复孔， 实验重复3 次。
1.2.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期
Hela 细胞和Siha 细胞分别用含(0， 1.2， 2.4， 5.0 mM) SAHA的培养基培养48h 。胰酶消化成单细胞悬液， 1 000r/min 离心5min收集细胞， 加0.01mol/L PBS 洗涤离心2 次， 用4℃75% 乙醇固定过夜。1 000r/ min 离心5min ， 去掉乙醇固定液， PBS 洗涤2 次。加入PI 染液1ml(50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1% Triton-100)， 4℃孵育30min ， FCM检测凋亡细胞率。
1.2.4 RT- PCR 检测p53表达
分别收集用含(0， 1.2， 2.4， 5.0 m M) SAHA处理48h的细胞。用TRIZOL 提取细胞总mRNA， 参照说明书进行。提取的mRNA 用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度(A260 /A280>1.8)。取2μg mR-NA 为模板， 应用通用引物逆转录合成cDNA， 以cDNA 为模板进行PCR 扩增。P53 引物： 正义链5′-cctcttcggcccagtggac-3 ′， 反义链5′-ccgttttcgaccctgagag-3 ′，退火温度60℃， 共28 个循环， 扩增产物369bp ；β-actin 引物： 正义链5′-ggcatcgtgatggactccg-3 ′，反义链5′-gctggaaggtggacagcga-3 ′， 退火温度62℃， 共28个循环， 扩增产物594bp 。扩增条件为：94 ℃预变性3 min； 94 ℃ 40 s， 56 ℃ 40 s， 72 ℃ 1min， 30 个循环； 72 ℃延伸7 min。取PCR 产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳( 100 V， 30 min) 。凝胶成像系统成像， 经薄层扫描求得每个待测产物与β-actin 产物光密度之比， 进行半定量分析。 PCR 产物在1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳， 电泳结果用英国UVP 公司GDS8000 型全自动图像分析系统处理。
1.6 Western blot 分析p53蛋白表达水平 分别收集0， 1.2， 2.4， 5.0 m M SAHA 处理72 h 的细胞， 提取蛋白质， 采用Bradford 法定量蛋白质，取50μg蛋白进行SDS- PAGE 凝胶电泳。然后电转膜到硝酸纤维素膜上。室温下摇动封闭4h。TBS-T洗涤3 次， 加一抗(p53按1 ∶100 稀释)在4 ℃下过夜。室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联兔抗小鼠IgG 抗体， 洗去未结合的二抗， 滴加化学发光剂ECL 进行发光显影。TBS- T 洗涤3 次，再用二抗(1 ∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)振荡孵育2h 。采用化学发光法( ECL)显影。
1.3 统计学处理
计量资料用均数±标准差(±s) 表示，用SPSS11.5 软件进行统计，数据比较采用t 检验，单变量多组资料之间比较采用单因素方差分析， 以P<0.05 为差异具有统计学意义。 (魏萍 李苓 张玮 张小玲 张婷婷 盛修贵)
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDI)是一类特异性抑制组蛋白去乙酰化酶、促进染色质解螺旋、增强其趋近性，从而调节基因转录的小分子化合物。体内、外研究证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成及转移、降低肿瘤侵袭力等机制发挥抗肿瘤作用，与放射联合还有放射增敏作用[1]。
近来研究表明， 异羟肟酸有组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase ， HDAC)抑制剂活性， 可抑制多种肿瘤细胞生长。异羟肟酸被广泛称为低毒性HDAC抑制剂。Tambunan US[2]等研究提出了利用苯三唑对异羟肟酸修改，获得一个更好的抑制剂。本研究观察异羟肟酸对宫颈癌Hela 和Siha 细胞株生长和细胞周期的影响及p53mRNA 和蛋白表达改变。
1.材料与方法
1.1 材料
异羟肟酸购自Sigma 公司，用PBS 稀释成500mmol/L， 过滤分装，贮藏于- 20℃。P53抗体购自Santa Cruz 公司，为鼠抗人单抗。RPMI-1640 (Gibco 公司)。TRIZOL 试剂购自Invitrogen 公司。新生牛血清(杭州四季青)。FACSort 流式细胞仪为美国Becton Dickson 公司产品。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)；AnnexinV-FITC 凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson 公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞和细胞培养
Hela 和Siha 细胞株由本科室保存。细胞在5% CO2、37℃条件下，用含10% 新生牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)的RPMI-1640 培养液培养传代。
1.2.2 MTT 实验检测生长抑制率
取对数生长期宫颈癌细胞，按细胞浓度为5×104/ 孔接种于96 孔板。37℃、5%CO2 饱和湿度培养24h 后， 分别加入不同浓度SAHA(0， 1.2， 2.4， 5.0 mM) 的培养基，每孔200μl，对照组不做处理。分别于加药后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT 溶液(5mg/ml)20μl， 37℃避光培养4h。彻底吸去MTT 溶液，加入二甲基亚砜150μl/孔， 震荡10min， 酶标仪490nm激发波长检测吸光度。计算细胞的生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1- 实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。每次实验设3 复孔， 实验重复3 次。
1.2.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期
Hela 细胞和Siha 细胞分别用含(0， 1.2， 2.4， 5.0 mM) SAHA的培养基培养48h 。胰酶消化成单细胞悬液， 1 000r/min 离心5min收集细胞， 加0.01mol/L PBS 洗涤离心2 次， 用4℃75% 乙醇固定过夜。1 000r/ min 离心5min ， 去掉乙醇固定液， PBS 洗涤2 次。加入PI 染液1ml(50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1% Triton-100)， 4℃孵育30min ， FCM检测凋亡细胞率。
1.2.4 RT- PCR 检测p53表达
分别收集用含(0， 1.2， 2.4， 5.0 m M) SAHA处理48h的细胞。用TRIZOL 提取细胞总mRNA， 参照说明书进行。提取的mRNA 用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度(A260 /A280>1.8)。取2μg mR-NA 为模板， 应用通用引物逆转录合成cDNA， 以cDNA 为模板进行PCR 扩增。P53 引物： 正义链5′-cctcttcggcccagtggac-3 ′， 反义链5′-ccgttttcgaccctgagag-3 ′，退火温度60℃， 共28 个循环， 扩增产物369bp ；β-actin 引物： 正义链5′-ggcatcgtgatggactccg-3 ′，反义链5′-gctggaaggtggacagcga-3 ′， 退火温度62℃， 共28个循环， 扩增产物594bp 。扩增条件为：94 ℃预变性3 min； 94 ℃ 40 s， 56 ℃ 40 s， 72 ℃ 1min， 30 个循环； 72 ℃延伸7 min。取PCR 产物5 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳( 100 V， 30 min) 。凝胶成像系统成像， 经薄层扫描求得每个待测产物与β-actin 产物光密度之比， 进行半定量分析。 PCR 产物在1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳， 电泳结果用英国UVP 公司GDS8000 型全自动图像分析系统处理。
1.6 Western blot 分析p53蛋白表达水平 分别收集0， 1.2， 2.4， 5.0 m M SAHA 处理72 h 的细胞， 提取蛋白质， 采用Bradford 法定量蛋白质，取50μg蛋白进行SDS- PAGE 凝胶电泳。然后电转膜到硝酸纤维素膜上。室温下摇动封闭4h。TBS-T洗涤3 次， 加一抗(p53按1 ∶100 稀释)在4 ℃下过夜。室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联兔抗小鼠IgG 抗体， 洗去未结合的二抗， 滴加化学发光剂ECL 进行发光显影。TBS- T 洗涤3 次，再用二抗(1 ∶5 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)振荡孵育2h 。采用化学发光法( ECL)显影。
1.3 统计学处理
计量资料用均数±标准差(±s) 表示，用SPSS11.5 软件进行统计，数据比较采用t 检验，单变量多组资料之间比较采用单因素方差分析， 以P<0.05 为差异具有统计学意义。 (魏萍 李苓 张玮 张小玲 张婷婷 盛修贵)