辛伐他汀对全脑缺血/再灌注损伤大鼠血脑屏障的保护作用及机制研究(1)
【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2018)07--01
脑缺血/再灌注损伤(CIRI)是指在脑缺血后血液恢復灌注所致的脑损伤加重现象[1]。如何防治CIRI是脑复苏研究的热点及难点问题。大量研究证实，CIRI与血-脑屏障(BBB)破坏密切相关，CIRI可导致BBB中ZO-1、occludin、claudin-5等细胞间紧密连接相关蛋白表达降低，从而造成紧密连接开放，BBB通透性增加，大量内毒素及炎症细胞因子经血管壁渗入脑组织，进而加剧脑组织损伤[2]。因此，增加BBB紧密连接稳定性、阻断BBB损伤是减轻CIRI的关键环节。辛伐他汀作为经典的降脂药物，具有调节血脂、抗血栓及延缓动脉粥样硬化等作用，并被广泛应用于心脑血管疾病的治疗[3]。近年来随着研究的深入，辛伐他汀对脑CIRI的保护作用也日益受到关注[4]。但其防治CIRI的作用机制尚未明确。本研究旨在探讨辛伐他汀对CIRI大鼠BBB损伤的保护作用，并从紧密连接相关蛋白调控水平阐明其抗CIRI的作用机制，以期为临床提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 6周龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。动物适应性饲养1周后采用随机数字表法对大鼠进行分组，共分为5组，即假手术组、模型组、10 mg·kg-1辛伐他汀组、20 mg·kg-1辛伐他汀组及40 mg·kg-1辛伐他汀组。
1.2 材料 辛伐他汀(海正辉瑞制药有限公司)；ZO-1、occludin、claudin-5单克隆抗体(大连santa cruz公司)；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物试剂有限公司)。
1.3 脑缺血/再灌注损伤模型建立及干预 模型组及辛伐他汀组大鼠采用Kouzumi线栓法制备大鼠脑脑缺血/再灌注损伤模型，具体操作如下：0.3ml/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，常规备皮并切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉，结扎左侧颈总动脉近心端并做一V字型小开口，将直径0.32～0.36 mm的尼龙鱼线从剪口处顺着颈内动脉方向插入，确认线栓成功插入至大脑中动脉近端后扎紧左侧颈总动脉远心端，缝合切口，插入深度约为18～20 mm，常规缝合切口。缺血2 h后将线栓缓慢拔除10 mm，使头端撤回至颈内动脉，实现再灌注。假手术组仅游离血管，并不插入尼龙鱼线，随后缝合。再灌注后1 h，10 mg·kg-1辛伐他汀组、20 mg·kg-1辛伐他汀组、40 mg·kg-1辛伐他汀组大鼠分别灌胃10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1辛伐他汀，1次/d，连续3 d。假手术组和模型组灌胃等量生理盐水。
1.4 神经功能损伤程度评估 再灌注后72 h，对各组大鼠进行神经功能损伤程度评估，无神经功能障碍计0分；大鼠尾巴提起后向对侧前肢屈曲计1分；原地打转，静止时身体未偏向对侧计2分；原地打转，静止时身体偏向对侧计3分；严重意识障碍计4分。
1.5 脑组织水含量 再灌注后72 h，大鼠处死，取出梗死侧大脑半球，称量脑组织湿重，再将脑组织置于100℃烤箱内烘烤至恒重，后称量脑组织干重。脑组织含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。
1.6 梗死灶皮层ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达 采用western blot法检测梗死灶皮层ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达。再灌注后72 h，取大鼠脑组织，常规提取组织蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4 h，后分别依次加入ZO-1、occludin、claudin-5单克隆抗体(1：2000)、二抗(1：500)孵育，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。
1.7 统计学方法 采用SPSS20.0进行数据分析，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较用one-way ANOVA检验，两两间比较用LDS-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组脑缺血/再灌注损伤程度比较 与假手术组相比较，模型组大鼠神经功能损伤评分及脑组织含水量均较假手术组显著增高(P<0.05)，10～40 mg·kg-1辛伐他汀组神经功能损伤程度及脑组织含水量均较模型组显著降低(P<0.05)(见表1)。
2.2 各组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达比较 与假手术组相比较，模型组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达显著降低(P<0.05)，10～40 mg·kg-1辛伐他汀组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达较模型组显著增高(P<0.05)，且呈明显剂量依赖性(见表3、图1)。
3 讨论
BBB是指存在于脑组织和血液之间的一个复杂的生物系统，主要由细胞间紧密连接、微血管内皮细胞及连续基底膜等结构构成，其可控制血循环中某些物质向中枢神经系统的转运，从而保持中枢神经系统内环境的相对稳定[5]。细胞间紧密连接是BBB最主要的物质结构基础，其可通过封闭脑部微血管内皮细胞间隙，阻止细胞外水、离子和大分子物质经细胞间隙进入脑组织内部[6]。动物实验发现，紧密连接相关蛋白与紧密连接结构稳定性密切相关，大鼠短暂性脑缺血再灌注后，BBB可通过细胞旁途径抑制紧密连接相关蛋白ZO-1表达，导致紧密连接开放，从而增加BBB通透性[7]。本研究结果显示，CIRI模型组大鼠神经功能损伤程度、脑组织含水量在再灌注后72h较假手术组明显升高(P<0.05)，提示CIRI可致BBB通透性增加，而这也是导致脑组织损伤加重的主要原因；同时，CIRI模型组大鼠ZO-1、occludin、claudin-5表达较假手术组明显降低(P<0.05)，其趋势与BBB通透性改变相反。ZO-1、occludin、claudin-5均为细胞间紧密连接的重要结构蛋白，其不仅表达于紧密连接，同样也表达于粘附连接，在紧密连接的形成及定位方面发挥重要作用，上述蛋白表达水平的高低与BBB的开放或关闭密切相关。本研究结果提示，ZO-1、occludin、claudin-5等紧密连接相关蛋白缺失是导致BBB破坏的重要环节，与国内研究结论一致[8]。 (李伟军)
脑缺血/再灌注损伤(CIRI)是指在脑缺血后血液恢復灌注所致的脑损伤加重现象[1]。如何防治CIRI是脑复苏研究的热点及难点问题。大量研究证实，CIRI与血-脑屏障(BBB)破坏密切相关，CIRI可导致BBB中ZO-1、occludin、claudin-5等细胞间紧密连接相关蛋白表达降低，从而造成紧密连接开放，BBB通透性增加，大量内毒素及炎症细胞因子经血管壁渗入脑组织，进而加剧脑组织损伤[2]。因此，增加BBB紧密连接稳定性、阻断BBB损伤是减轻CIRI的关键环节。辛伐他汀作为经典的降脂药物，具有调节血脂、抗血栓及延缓动脉粥样硬化等作用，并被广泛应用于心脑血管疾病的治疗[3]。近年来随着研究的深入，辛伐他汀对脑CIRI的保护作用也日益受到关注[4]。但其防治CIRI的作用机制尚未明确。本研究旨在探讨辛伐他汀对CIRI大鼠BBB损伤的保护作用，并从紧密连接相关蛋白调控水平阐明其抗CIRI的作用机制，以期为临床提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 6周龄SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重(250±20)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司。动物适应性饲养1周后采用随机数字表法对大鼠进行分组，共分为5组，即假手术组、模型组、10 mg·kg-1辛伐他汀组、20 mg·kg-1辛伐他汀组及40 mg·kg-1辛伐他汀组。
1.2 材料 辛伐他汀(海正辉瑞制药有限公司)；ZO-1、occludin、claudin-5单克隆抗体(大连santa cruz公司)；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物试剂有限公司)。
1.3 脑缺血/再灌注损伤模型建立及干预 模型组及辛伐他汀组大鼠采用Kouzumi线栓法制备大鼠脑脑缺血/再灌注损伤模型，具体操作如下：0.3ml/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，常规备皮并切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉，结扎左侧颈总动脉近心端并做一V字型小开口，将直径0.32～0.36 mm的尼龙鱼线从剪口处顺着颈内动脉方向插入，确认线栓成功插入至大脑中动脉近端后扎紧左侧颈总动脉远心端，缝合切口，插入深度约为18～20 mm，常规缝合切口。缺血2 h后将线栓缓慢拔除10 mm，使头端撤回至颈内动脉，实现再灌注。假手术组仅游离血管，并不插入尼龙鱼线，随后缝合。再灌注后1 h，10 mg·kg-1辛伐他汀组、20 mg·kg-1辛伐他汀组、40 mg·kg-1辛伐他汀组大鼠分别灌胃10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1辛伐他汀，1次/d，连续3 d。假手术组和模型组灌胃等量生理盐水。
1.4 神经功能损伤程度评估 再灌注后72 h，对各组大鼠进行神经功能损伤程度评估，无神经功能障碍计0分；大鼠尾巴提起后向对侧前肢屈曲计1分；原地打转，静止时身体未偏向对侧计2分；原地打转，静止时身体偏向对侧计3分；严重意识障碍计4分。
1.5 脑组织水含量 再灌注后72 h，大鼠处死，取出梗死侧大脑半球，称量脑组织湿重，再将脑组织置于100℃烤箱内烘烤至恒重，后称量脑组织干重。脑组织含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%。
1.6 梗死灶皮层ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达 采用western blot法检测梗死灶皮层ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达。再灌注后72 h，取大鼠脑组织，常规提取组织蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4 h，后分别依次加入ZO-1、occludin、claudin-5单克隆抗体(1：2000)、二抗(1：500)孵育，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。
1.7 统计学方法 采用SPSS20.0进行数据分析，计量资料用均值±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较用one-way ANOVA检验，两两间比较用LDS-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组脑缺血/再灌注损伤程度比较 与假手术组相比较，模型组大鼠神经功能损伤评分及脑组织含水量均较假手术组显著增高(P<0.05)，10～40 mg·kg-1辛伐他汀组神经功能损伤程度及脑组织含水量均较模型组显著降低(P<0.05)(见表1)。
2.2 各组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达比较 与假手术组相比较，模型组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达显著降低(P<0.05)，10～40 mg·kg-1辛伐他汀组大鼠梗死灶皮层中ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达较模型组显著增高(P<0.05)，且呈明显剂量依赖性(见表3、图1)。
3 讨论
BBB是指存在于脑组织和血液之间的一个复杂的生物系统，主要由细胞间紧密连接、微血管内皮细胞及连续基底膜等结构构成，其可控制血循环中某些物质向中枢神经系统的转运，从而保持中枢神经系统内环境的相对稳定[5]。细胞间紧密连接是BBB最主要的物质结构基础，其可通过封闭脑部微血管内皮细胞间隙，阻止细胞外水、离子和大分子物质经细胞间隙进入脑组织内部[6]。动物实验发现，紧密连接相关蛋白与紧密连接结构稳定性密切相关，大鼠短暂性脑缺血再灌注后，BBB可通过细胞旁途径抑制紧密连接相关蛋白ZO-1表达，导致紧密连接开放，从而增加BBB通透性[7]。本研究结果显示，CIRI模型组大鼠神经功能损伤程度、脑组织含水量在再灌注后72h较假手术组明显升高(P<0.05)，提示CIRI可致BBB通透性增加，而这也是导致脑组织损伤加重的主要原因；同时，CIRI模型组大鼠ZO-1、occludin、claudin-5表达较假手术组明显降低(P<0.05)，其趋势与BBB通透性改变相反。ZO-1、occludin、claudin-5均为细胞间紧密连接的重要结构蛋白，其不仅表达于紧密连接，同样也表达于粘附连接，在紧密连接的形成及定位方面发挥重要作用，上述蛋白表达水平的高低与BBB的开放或关闭密切相关。本研究结果提示，ZO-1、occludin、claudin-5等紧密连接相关蛋白缺失是导致BBB破坏的重要环节，与国内研究结论一致[8]。 (李伟军)