(中石化上海工程有限公司，上海 200120)

    慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒载体能够有效地感染神经元细胞、干细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，临床研究的效果非常理想，具有广阔的应用前景[1]。

    近几年已经有一些国内的公司开始了慢病毒载体领域产品的生产和临床实验，不久会有一定数量的慢病毒载体领域产品的生产车间将要建成。本文根据国家现行的法律法规，并结合某一项目对慢病毒载体生产车间的工程设计进行分析。

    1 慢病毒载体生产的特点

    1.1 慢病毒载体包装步骤

    慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA 整合前复合体，进入细胞核后，DNA 整合到细胞基因组中。整合后的DNA 转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰[2]。

    慢病毒载体的构建主要分为转染、收集、转导和表达四个步骤，如图1所示。

    图1 慢病毒载体包装工艺流程Fig.1 Process flow diagram of lentiviral vector

    1.2 慢病毒包装方法

    慢病毒包装主要有构建稳定包装细胞系和质粒瞬时转染2 种方法。质粒的瞬时转染简化了慢病毒的生产的操作，并缩短了生存时间，从而避免了含有稳定载体包装系统的细胞系长周期的培养，所以目前用于基因治疗临床试验的慢病毒主要采用瞬时转染[3]。

    1.3 细胞培养方法

    目前慢病毒载体大规模生产主要分为贴壁细胞扩大培养和悬浮细胞扩大培养两种方式[4]。贴壁细胞培养方法主要有细胞工厂、微载体培养等。对工业化生产来说，在大的生物反应器中培养细胞最便捷的方式是用悬浮细胞扩大法。

    1.4 慢病毒的纯化

    慢病毒必须去除产品中的蛋白杂质、DNA 杂质、内毒素等来确保产物的质量、安全及有效，从而达到人体基因治疗的效果。目前的纯化手段有：离心、膜分离、核酸酶消化和层析。慢病毒在生理pH 下呈负电荷，离子交换层析是慢病毒纯化中最有效的层析方法，可高效除去杂蛋白与DNA，同时起到浓缩的作用 ......