黄晓燕，高瞻，周希，梁万前，陈锡文，陈通克，杨德业(.温州医学院附属第一医院 心内科，温州医学院 心血管生物和基因研究所，浙江 温州35000；.温州医学院 实验动物中心，浙江 温州 35035)

    先天性心脏病-室间隔缺损(ventricular septum defect，VSD)是常见的心血管疾病，但我们对其致病因素及发病机制却仍知之甚少。骨形态形成蛋白受体IA(bone morphogenetic protein receptor type 1A，又名ALK3)在心脏发育及室间隔形成中发挥重要作用[1-2]。已有心脏特异性ALK3基因敲除的小鼠模型培育成功[3]。ALK3基因敲除纯合子小鼠胚胎发育皆终止于中期，并伴室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不全[4]、心肌细胞凋亡增加[5]。在ALK3基因缺失造成心脏发育异常的具体通路的实验研究中，杨德业教授的团队发现转录因子paired box gene 8(Pax-8)在ALK3基因敲除的纯合子小鼠胚胎心脏中下调了7.1倍[6-8]。Pax-8参与心脏的正常发育，并与心肌细胞的凋亡有关[9]，Pax-8表达下调时细胞凋亡显著增加，细胞增殖活性下降[10]。

    为了探讨Pax-8基因下调后引起细胞凋亡增多的机制，基因芯片和荧光实时定量PCR技术被应用于筛选Pax-8基因敲除小鼠差异表达的下游基因。

    1 材料和方法

    1.1 实验动物及分组 Pax-8基因敲除小鼠模型由德国Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠赠。Pax-8基因敲除小鼠纯合子(Pax-8 KO-/-)为实验组，Pax-8基因敲除小鼠杂合子(Pax-8 KO+/-)和野生型(Pax-8 KO+/+)为对照组。纯合子和杂合子小鼠由雌性Pax-8 KO+/-小鼠与雄性Pax-8 KO+/-小鼠交配所得。

    1.2方法

    1.2.1 Pax-8基因敲除小鼠的基因型鉴定：实验小鼠基因型由PCR法鉴定。引物为5’-GGATGTGGAA TGTGTGCGAGG-3’、5’-GCTAAGAGAAGGTGGATGAGAG-3’，和5’-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3’。PCR条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，经过10个循环后，再94 ℃变性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，经过25个循环后，72 ℃延伸5 min。每组扩增产物取5μL，用含Gold View的1.5%琼脂糖凝胶电泳 ......