高国辉，黄奇迪，王金丹，杨水兵，杨娟，张凤立，胡孝渠

    (1.温州医学院 生命科学院，浙江 温州 325035；2.温州医学院附属第一医院 肿瘤外科，浙江温州 325000；3.温州医学院 仁济学院，浙江 温州 325035)

    人表皮生长因子受体2(the human epidermal growth factor receptor 2，HER2)是定位于17号染色体长臂上的癌基因[1]，该基因的表达状态与肿瘤的恶性程度呈正相关，是典型的恶性肿瘤标志物。目前，以HER2为靶标对肿瘤细胞进行靶向生物治疗是临床肿瘤治疗的热点之一[2-4]。

    抗HER2单链抗体片段(anti-HER2 single chain fragment variable，anti-HER2 ScFv)是抗HER2免疫球蛋白Fab片段中的可变区部分，其分子小、穿透实体瘤能力强、靶向特异性明显。研究表明，将Anti-HER2 ScFv与其他肿瘤细胞杀伤性多肽重组，构建融合蛋白用于药物靶向性研究将具有十分重要的应用价值[5-7]。 但是，这些融合蛋白靶向结合HER2的结果验证大多需要间接免疫法或流式细胞仪计数判断最终结果，鉴定步骤较多，误差大。

    本研究拟以绿色荧光蛋白(green fluorecent protein，GFP)为报告基因，构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP，在原核表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白的抗HER2单链抗体，观察该融合单链抗体结合乳腺癌细胞表面受体后活细胞表面绿色荧光的分布，分析其应用于靶向治疗HER2阳性肿瘤和分子诊断的可能。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 基因片段、菌种与载体：鼠源性人抗HER2-ScFv片段由中山大学医学院宋尔卫教授课题组提供，GFP片段由浙江大学生命科学院吴敏教授惠赠，大肠杆菌E.coliTG1、E.coliTOP10、原核表达载体pBAD His B由本实验室保存， pGEM T easy Vector购于Promega公司。

    1.1.2 主要试剂：T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、中分子量蛋白Marker、NC膜购于Promega公司，限制性内切酶EcoRI、HindIII、BamHI、dNTPs、DNA Marker DL2000、DNA Marker 4500均为Takara公司产品；鼠抗GFP-Tag mAb、Goat Anti-Mouse IgG-HRP、DAB为ABMART公司产品，DNA Gel PurfiicatoinKti3.1为上海申能博彩生物科技有限公司产品；质粒抽提试剂盒购于Omega公司 ......