翁丛丛，方益民，黄润巧，林冬冬，张洪勤，施孟如

    (温州医学院，浙江 温州 325035，1.生物系；2.生物学教学中心)

    大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

    翁丛丛1，方益民1，黄润巧1，林冬冬1，张洪勤2，施孟如2

    (温州医学院，浙江 温州 325035，1.生物系；2.生物学教学中心)

    目的：通过将大肠杆菌BL21中MnSOD、FeSOD以及Cu/ZnSOD调控序列(包括启动子，-3518～+15 bp)与红色荧光蛋白(RFP)连接，构建成含SOD调控序列的红色荧光蛋白报告基因，用以研究不同SOD启动子对RFP的调控作用。方法：采用重组PCR技术，分别构建以MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD启动子驱动的RFP报告基因载体，并将构建的融合基因通过T克隆转化入大肠杆菌，通过不同浓度Cd2+作用，分别诱导RFP表达。结果：正确构建了三种SOD-RFP融合基因，重组PCR结果与测序结果完全一致；该报告基因在室温静息状态下，红色荧光有微弱表达，经Cd2+诱导后，红色荧光亮度明显增强，其中MnSOD调控序列驱动的RFP表达最为明显。结论：该报告基因载体的成功构建，为研究SOD的基因表达调控机制和研制检测环境中污染物的微生物传感器提供了重要基础和工具。

    超氧化物歧化酶；调控序列；重组PCR；红色荧光蛋白；基因，报告；大肠杆菌

    当处于极端温度、重金属等环境中，生物体氧自由基产生过多或对氧自由基清除能力下降，氧自由基通过链式自由基反应损伤细胞。机体清除氧自由基的过程主要包括超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)将氧自由基通过歧化反应转变为H2O2，随后过氧化氢酶(CAT)将H2O2转变为O2和H2O[4]。SOD是一种广泛存在于生物体中的金属酶，根据其所结合的金属离子的不同，可分为MnSOD(SODA)、FeSOD(SODB)、Cu/ZnSOD(SODC)三种类型[1-3]。段学军等[5]的研究表明，机体总SOD活性会随着重金属的刺激而增加，然而具体是哪一种SOD起主导作用尚未能阐明。因此，本实验应用重组PCR技术，分别构建以SODA、SODB、SODC启动子驱动的红色荧光蛋白(RFP)报告基因载体，经不同浓度Cd2+刺激，诱导RFP基因表达，通过检测RFP荧光强度变化，从而研究不同SOD启动子在Cd2+诱导下对RFP的调控作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 RFP报告基因和菌种：含RFP基因的大肠杆菌BL21由浙江大学惠赠 ......