朱利斌，张普，黄婷，王永彪

    (温州医学院附属育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.儿外科；2.病理科)

    先天性巨结肠(Hirschprung’s disease，HD)手术治疗效果如何，依赖术中是否准确切除病变肠管，但仅凭术者经验，过多切除正常的肠管，则正常肠管总长度减少，患儿易患营养不良、慢性腹泻等疾病，而且增加手术时间及手术风险；反之切除肠管过少，病变段肠管未完全切除，患儿仍有持续便秘，需再次手术，增加患儿的痛苦及经济上的压力。因此，在手术中急需一个行之有效、快速、规范、易操控的、客观的诊断方法。以往的术中快速诊断方法有：冰冻切片HE染色、乙酰胆碱脂酶(AchE)染色、乳酸脱氢酶(LDH)染色法等，对肠神经节细胞的有效识别率不高，操作流程繁琐，并且诊断依赖于病理科医师的主观经验，均不甚理想。本研究改进了一种基于NADPH-d的快速组织学染色方法，供手术当中快速诊断HD，确定肠管切除范围，介绍如下。

    1 材料和方法

    1.1 标本及分组 本研究所用标本均取自手术中切除肠管，并经我院伦理委员会批准。自2008至2011年37例HD患儿术中切除的结肠，其中男27例，女10例，年龄5～19个月，平均11.6个月。分扩张段、移形段、狭窄段，制片后分批超低温冰箱保存，以非HD结肠造瘘切除标本作为阳性对照。分NADPH-d快速染色法组、冰冻切片HE染色法组。

    1.2 制片 标本常规冰冻连续切片，片厚4μm，多聚赖氨酸载玻片贴片，取奇数切片做NADPH-d的快速组织学染色，偶数切片做冰冻切片HE染色。

    1.3 NADPH-d的快速组织学染色方法 反应液组成：1 mL 0.1 mol/L PB(pH 8.0)液中加入0.5 mg NADPH-d(Sigma)、0.6 mg NBT(Sigma)、10μL二甲基亚砜(苏州正兴化工研究院)、3μL Triton X-100(北京拜尔迪生物公司)。滴加反应液后载玻片置于37 ℃水浴箱中10 min，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，水性封片剂封片。阴性对照：反应液中不加入NADPH-d。阳性对照：已知阳性组织(结肠造瘘切除标本)同时进行染色。

    1.4 冰冻切片HE染色方法 冰冻切片切好后，室温下干燥。4%多聚甲醛固定5 min，蒸馏水洗2 min，苏木素染(37 ℃)1 min ......