嵇晓利，刘劲松，徐海红，刘传通，张大风，麻健丰

    (温州医学院附属口腔医院 口腔修复科，浙江 温州 325027)

    近年来，基因治疗在骨组织工程中受到越来越多的关注。基因治疗的关键在于如何借助载体将外源基因准确有效地导入靶细胞。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然转染效率高，但存在自身难以克服的局限性，如能诱导宿主免疫反应及潜在的致癌性，制备复杂等。而非病毒载体具有安全性高，免疫原性低，易于组装，体内可反复应用等优势，使其在组织工程中应用逐渐增多。阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、多聚赖氨酸、阳离子脂质体等是目前应用最多的非病毒载体类型。1995年Boussif等[1]首次使用PEI作为非病毒载体将DNA有效地转移到神经元细胞。随后的研究发现，PEI可缩合质粒DNA，具有特殊的“质子海绵效应”，不需溶酶体抑制剂即可转染细胞。PEI被认为是目前最为有效的非病毒载体之一[2-3]。PEI介导的基因转染效率受多方面因素影响，其中N/P值(PEI与DNA的氮磷比，即PEI的氨基与DNA的磷酸基团的摩尔比例)对其影响最大[4]。因此，本实验考察PEI与含骨形态发生蛋白-7基因(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)质粒形成的纳米复合物N/P值对复合物转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，MSC)表达BMP-7以及细胞毒性的影响，从而筛选出较优的转染条件，为PEI作为非病毒载体在骨组织工程中的应用提供实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料及仪器 pcDNA3.1-BMP-7质粒(由四川大学蒋嫒医师惠赠)；大肠杆菌；出生1周SD大鼠；PEI分子量为25 kD，分枝型(Sigma，美国)；质粒大量抽提试剂盒(Qiagen公司，德国)；ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程公司)；粒径/Zeta电位测定仪(Malvern，英国)。

    1.2 PEI/DNA复合物的制备 BMP-7质粒转化大肠杆菌并按照质粒DNA的提取试剂盒操作手册进行pcDNA3.1-BMP-7质粒的大量扩增。精密称取适量PEI溶于PBS(pH 7.4，150 mmol/L)，制得1 mg/mL的储备液。将储备液稀释成0.1 mg/mL的PEI试液，并与质粒溶液(0.1 mg/mL)按一定的N/P值(0.5、1、3、5、7、10、20和30)轻摇混合，静止30 min备用。

    1.3 PEI/DNA复合物粒径及Zeta电位测定 采用粒径/Zeta电位测定仪测定已经制备的纳米复合物的粒径以及Zeta电位值 ......