朱天琦，郑声星

    (1.温州医学院附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325000；2.温州医学院附属第二医院 麻醉科，浙江 温州 325027)

    急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床常见危重病，其病死率极高，大约在40%～70%，由内毒素血症引起的ARDS极为常见。成纤维细胞作为间质的主要成分，其对炎症的成功消退过程起到了重要的作用。而在体外培养成纤维细胞并建立其急性炎症模型是研究成纤维细胞在ARDS过程中促炎症消退作用的重要方法之一。本研究用不同剂量的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激体外培养的肺成纤维细胞(lung fiibroblasts，LF)，并在不同时间点通过细胞毒性检测来评价内毒素性细胞的损伤程度，旨在建立合理的体外细胞ARDS模型。

    1 材料和方法

    1.1 动物 SPF级健康Sprague Dawley(SD)雄性大鼠60只，体质量120～150 g，平均(132±10)g由同济医学院实验动物中心提供(医动字第19-025号)。

    1.2 主要试剂 内毒素(LPS，E.coil serotype 055：B5)，细胞增殖/毒性检测试剂(MTT)为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，购自美国sigma公司。用超纯水溶解的H-DMEM的培养基(Gibco公司)，消化液:0.25%胰蛋白酶(Sigma公司)。抗波形蛋白(vimentin)单克隆抗体和CD31单克隆抗体，均购自abcam公司。

    1.3 LF的分离、培养 参照Tamm等[1]的组织贴壁方法并进行改良，大鼠称重，腹腔注射2%戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉，仰卧位固定。沿腹中线剪开皮肤、皮下组织，暴露腹腔，切断腹主动脉放血，剪掉横膈膜，暴露胸腔，截取胸骨，小心折断肋骨，摘除胸腺，最大限度地暴露心脏及大血管，从右心室插入套管至肺动脉，用D-Hanks液灌洗至肺明显发白，完整地取出心肺气管，除去心脏和大气道，置于放有预冷的D-Hanks(青霉素100 IU/mL、链霉素100 IU/mL)的无菌培养皿中 ......