张欢，吴金明，陈娟，方红龙

    (温州医学院附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325000)

    乙肝病毒性肝炎是世界范围内广泛传播的传染病，控制乙型肝炎病毒(HBV)的复制、缓解肝组织活动性病变是医学界需要长期攻克的堡垒。近几年来研究表明HBV感染的控制和清除有赖于机体的免疫系统，其感染慢性化与机体针对HBV的特异性免疫，尤其是细胞免疫的缺陷与低下有关。但现在的抗病毒药物均不能纠正这种免疫缺陷，基于上述情况，探索新的治疗性疫苗具有现实意义。治疗疫苗与预防疫苗不同，是基于病毒慢性感染时，机体的免疫系统处于不合适的免疫状态，不能有效清除病毒感染的理论基础而提出的新的治疗策略[1]。乙肝治疗性疫苗着眼于增强或恢复机体针对HBV的特异性免疫，尤其是特异性T细胞免疫，以控制和清除病毒而不损伤肝细胞，最终达到消除HBV感染的目的。

    1 材料和方法

    1.1 材料 NheI和BamHI限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas，质粒提取试剂盒及pEGFPN1质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，PCR引物序列合成及DNA序列测定由上海捷瑞生物有限公司完成。ayr亚型HBV e基因序列由上海捷瑞生物有限公司合成(GeneBank编号NC_003977)，人CD40L胞外段基因序列(GeneBank编号NM_000074)，连接链(Linker)氨基酸序列为GGGG。

    1.2 pEGFP-N1-HBe(385-420)-ecdCD40L真核表达载体的构建

    1.2.1 根据HBe(385-420)基因序列以及人CD40L胞外段基因序列合成并纯化4条引物，序列如下：上游引物A：5’-GCTAGCGATGCCTCCCG-3’，中间引物B：5’-TTCTATGAAGGCCGCC-3’，中间引物C：5’-CGGCGGCG GCCTTCATAGA-3’，下游引物D：5’-GGATCCCGGAGTTTGA GTAAGC-3’。A为HBe(385-420)基因的上游引物，引入NheI酶切位点；B和C是部分互补的 ......