杨凯，缪晓燕，陈琼斯，章婷婷，叶薇，吕建新

    (温州医学院 检验医学院，浙江 温州 325035)

    甲苯生物降解的关键酶基因克隆及表达

    杨凯，缪晓燕，陈琼斯，章婷婷，叶薇，吕建新

    (温州医学院 检验医学院，浙江 温州 325035)

    目的：克隆、表达恶臭假单胞菌生物降解甲苯的关键酶基因。方法：恶臭假单胞菌WZ-1在含甲苯的MS培养基中培养以鉴定其降解甲苯的能力。设计引物扩增甲苯生物降解的关键酶——甲苯双加氧酶和邻苯二酚1，2双加氧酶基因，PCR扩增目的片段后进行T-A克隆，筛选阳性克隆并鉴定。构建甲苯双加氧酶-pET28a进行体外诱导表达。结果：恶臭假单胞菌WZ-1在含甲苯的MS培养基的生长曲线证明其具有降解甲苯的能力；通过重组技术获得阳性克隆，并以酶切、DNA测序进行鉴定；IPTG诱导后获得重组甲苯双加氧酶的高表达。结论：成功获得了用于降解甲苯的甲苯双加氧酶基因和邻苯二酚1，2双加氧酶基因，并在体外诱导表达了目的蛋白，为后续利用模式生物对苯系物的生物降解建立了实验基础。

    恶臭假单胞菌；甲苯；克隆；原核表达

    苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzene)和二甲苯(xylene)等单环芳烃化合物，缩写为BTEX，是一类重要的环境污染物，广泛来源于石油冶炼、农药生产、印染化工等工农业的生产、运输等各个过程。由于其化学性质稳定，且对人体的中枢神经具有急性危害作用，其一旦进入环境，不会自行消失，对环境和人类健康造成极大威胁。目前，国内外对BTEX的研究主要集中在两个方面：一是环境污染的降解研究，这部分多数以BTEX泄漏对地下水、土壤造成的污染为研究对象，进而研究生物净化修复技术；二是BTEX的高灵敏度分析方法技术研究[1-5]。在BTX的生物降解研究中，常利用质粒载体构建生物反应器，但由于质粒的遗传具有相对的独立性，经过几代的培养，很可能丢失，导致生物反应器失效；进入环境的质粒也可能污染其他的菌种，易造成潜在的环境风险性；而直接从环境中筛选的分解菌对生长环境要求高，适应性差，生长增殖速度慢，不利于工业上的大规模应用。因此将降解酶基因整合至无降解能力但易生长的细菌(如大肠杆菌)染色体，构建降解BTX的生物传感器，以此来实现对污染物的降解，无疑是一种安全、稳定、高性价比的解决方案。

    本研究以具有降解甲苯的菌株——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)为研究对象，对参与降解甲苯的生物酶基因——甲苯双加氧酶(toluene dioxygenase ......