万丽，罗旭，辛国华，李安乐，曾逃方，夏卫东，李校堃，林才

    (1.温州医学院附属第一医院 病理科，浙江 温州 325000；2.温州医学院附属第一医院 烧伤科，浙江 温州 325000；3.南昌大学第一附属医院 烧伤科，江西 南昌 330000；4.温州医学院 实验动物中心，浙江 温州 325035；5.宜春市人民医院 烧伤科，江西 宜春 336000；6.温州医学院 药学院，浙江 温州 325035)

    骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)具有多分化潜能及一定的免疫抑制作用，是组织工程的主要种子细胞之一[1]。在创伤的微环境中，MSCs能分泌多种细胞因子促进创伤的愈合及组织生理功能的恢复，是机体创伤修复的重要组织细胞[2-3]。本研究利用一种已经制备成功的微孔化脱细胞真皮基质(LPADM)[4]，在其上接种MSCs并复合自体刃厚皮移植进行动物在体实验，观察了解其对创面修复的效果。

    1 材料和方法

    1.1 LPADM的制备 取体质量约25 kg的健康小白猪，电动取皮刀取刃厚皮0.2 mm，去除表皮及基底膜层，然后在真皮组织上再切取约0.3 mm 断层真皮片，高渗盐溶液脱细胞、0.5%戊二醛交联Co60照射处理，在悬空的脱细胞真皮基质上采用电脑激光模板打孔技术(选用规格孔径：135μm，空间隙：1 mm)均匀贯穿性打孔，制作成LPADM真皮支架备用，详见文献[4]。

    1.2 MSCs的分离培养 选取4～6周健康雄性SD大鼠[脱臼法处死(动物使用许可证号：SYXK(浙)2010-0150]，无菌条件下取出股骨及胫骨，低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，细胞悬液以1000 r/min离心两次，每次5 min，弃上清及脂肪层。用含10% FBS的低糖DMEM培养基重悬细胞，加入Ficoll细胞分离液的试管中，以2000 r/min离心20 min，吸取单核细胞层，D-hanks液洗涤细胞2次，重悬细胞于含10%FBS的低糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养。3 d换液，弃去未贴壁细胞，保留贴壁细胞继续培养，当细胞达到50%融合时，胰蛋白酶消化传代，参照文献[5]方法获得MSCs。

    1.3 体外构建MSCs-LPADM、MSCs-PADM材料 超净台环境中将LPADM剪成2 cm×2 cm大小，将LPADM表皮面朝上放于6孔板中，加入到含10% FBS的低糖DMEM培养基中浸润，放入37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中保存4 h ......