王良国，黄晓燕，林素，潘嘉林，戴晓春，王本极，吴漪浩，杨德业

    (温州医学院附属第一医院 心内科，温州医学院 心血管生物和基因研究所，浙江 温州 325000)

    室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)是一种常见的先天性心脏病，但至今对其致病因素及发病机制仍知之甚少。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在胚胎发育和细胞分化中起重要作用，骨形态形成蛋白受体IA(bone morphogenetic protein receptor IA，BMPIA又名ALK3)属于TGF-β超家族，在心脏发育及心肌细胞分化中起重要作用[1-2]。美国Schneider教授创建了心脏特异的ALK3基因敲除的小鼠模型，仅在心脏敲除ALK3基因[3]，发现纯合子小鼠死于胚胎中期，并伴有VSD，心内膜垫和肌小梁发育不全[4]。ALK3基因在调控心脏发育和心肌细胞凋亡过程中起重要作用。杨德业教授实验室利用基因芯片筛选ALK3的下游基因，发现转录因子Pax-8在ALK3基因敲除的纯合子小鼠胚胎心脏中下调了7.1倍[5]，周希等[6]已证明Pax-8基因参与了心脏的发育，并通过抑制心肌细胞的凋亡而参与胚胎心脏的发育，而黄晓燕等[7]利用基因芯片检测小鼠基因表达水平，筛选出差异表达的基因，找到了Pax-8的下游基因NR4A1，其受Pax-8基因调控，在Pax-8保护细胞凋亡途径中发挥作用。为了进一步研究Pax-8下游基因NR4A1与心肌细胞凋亡之间的联系，本研究通过克隆NR4A1全长序列，构建含NR4A1基因的真核表达载体，为探讨NR4A1在心肌细胞凋亡过程中的功能做准备。

    1 材料和方法

    1.1 材料和试剂 Pax-8基因敲除小鼠模型由德国Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠赠；Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂、DEPC水(RNase-free and DNase-free)及各个PCR引物均购自Invitrogen公司；FBS、DMEM(low glucose)、0.05%胰酶/EDTA、Hanks均购自Gibco；RT试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)、Dnase I(Rnasefree 1 U/μL)购自MBI Fermantas公司；大鼠H9C2心肌细胞株购自中科院上海细胞库；高保真DNA聚合酶Prime STARTM HS DNA Poly-merase购自TAKARA公司；限制性内切酶购自NEB公司；DH5a菌种、超级感受态细胞制备试剂盒购自碧云天生物技术研究所；质粒抽提试剂盒购自Omega；T4连接酶购自Promega；PCR试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix)、封板膜及96孔板购自ABI公司；兔抗鼠NR4A1(NUR77)多克隆抗体购自abcam公司 ......