胡丽萍，陆红，白永恒，王斯璐，洪炜龙，林成成，梁勇，林向阳

    (温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000，1.医学检验中心；2.外科实验室)

    近年来，有关服用中草药导致的肾脏损害屡见报道，马兜铃酸(aristolochic acid，AA)就是其中之一。在体内，AA引起损伤的主要病理表现为炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞凋亡和坏死以及间质纤维化等[1]。目前AA致肾间质纤维化的分子机制尚不明确。我们前期研究显示，TGF-β1可能在AA诱导肾间质纤维化中发挥重要作用[2-3]。最近研究显示，GTPase Rho家族某些成员在调控TGF-β1中具有重要作用[4]。本研究拟通过体外实验观察AA对肾小管上皮细胞的损伤作用，同时探究GTPase Rho的重要成员Rac1蛋白在AA损伤小管上皮细胞过程中可能的作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料 AA(美国Sigma公司)；DMEM细胞培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶和TRIzol提取液(美国Gibco公司)；WST-1和Hoechst 33258染色液(上海碧云天公司)；兔抗鼠Rac1抗体(美国Santa Cruz公司)；兔抗鼠III型胶原抗体(Bioworld公司)；Rac1和TGF-β1 ELISA检测试剂盒(上海西唐生物)；RT-PCR试剂(美国Promega公司)；MYCYCLER梯度PCR仪(美国BIOROD公司)；7500定量PCR仪(美国Applied Biosystens公司)；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪(美国Thermo Scientific公司)；DM4000 B LED荧光正置显微镜(德国Leica公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。NRK-52E细胞在含5%小牛血清的DMEM培养液中，于37 ℃，5% CO2培养箱内培养。取细胞接种于6孔板中，待细胞70%～80%融合时，在培养液中加入AA，对照组加入含有等量溶剂的培养液。继续培养24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。

    1.2.2 WST-1法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的NRK-52E细胞，用胰酶消化，调整细胞密度为5×107/L，接种于96孔培养板中，每孔加入100μL培养液。待细胞贴壁后，实验组每孔加入浓度为5、10、20、50和100μg/mL的AA，并设6个平行孔，作用24 h，对照组加溶剂；另外 ......