袁航，屠世良

    (浙江省人民医院 肛肠外科，浙江 杭州 310014)

    由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于肿瘤发生机制、抗肿瘤药物检测、癌分子生物学等研究。较之目前国内大肠癌细胞研究多采用细胞株的方式，原代培养更符合体内生理状态，其实验数据更具有说服力。但原代培养因成功率低，时间、试剂、人力成本高等原因，未能被广泛应用。本研究通过综合国内外大肠癌细胞原代培养方法的报道，对各种培养方法加以改进利用，寻求更优化更高效的原代培养方法，以期为大肠癌基础研究做准备工作。

    1 材料和方法

    1.1 实验标本 标本来自手术切除的未经放射治疗和抗肿瘤化学药物治疗的新鲜无菌人大肠癌组织。大肠癌诊断以肿瘤组织的病理学检查为依据。取材按肿瘤大体类型、肿瘤分化程度、取材位置分类。

    按肿瘤大体类型：①肿块增生型：主要向肠腔内生长，呈球状或半球状；②溃疡浸润型：中央部坏死，形成大溃疡，边缘外翻呈蝶形，或癌组织沿肠壁浸润生长，有明显纤维组织反应。

    按肿瘤分化程度：癌细胞排列呈腺管状或腺泡状，按Broder法分为高分化(I级)、中分化(II级)、低分化(III级)和未分化(IV级)癌。取材时按照I～II级、III～IV级进行分类。

    按取材位置：①肿瘤中央；②肿瘤周边。按以上分类标准配对，即有8个取材方案。

    1.2 试剂及仪器 RPMI 1640培养液(含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10μg/mL胰岛素、生长激素100μg/L)、DMEM细胞培养基、Hanks洗液(含1000 U/mL青霉素、1000 U/mL链霉素、3μg/mL两性霉素)、胎牛血清、眼科剪、眼科镊、细胞计数板、自制鼠尾胶原铺制的培养瓶、CO2培养箱、倒置相差显微镜(Olympus)、超净工作台。

    1.3 实验方法

    1.3.1 不同取材标本对原代培养的影响：对培养条件采用正交设计进行研究[1]。如表1所示，按之前8个取材方案在2个不同标本中重复实验1次，进入表格内按不同方案培养，即组织块培养法+RPMI 1640培养基，组织块培养法+DMEM培养基，胶原酶消化法+RPMI 1640培养基，胶原酶消化法+DMEM培养基。注意取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避开，要挑选活力较好的部位。予培养3、7 d观察培养基中细胞分布情况，以组织块周围细胞生长来判断原代细胞生长情况。 ......