陈德准，吴漪皓，陆圣月，林素，黄晓燕，杨德业，2

    (1.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 325015；2.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江 杭州 310015)

    Smad蛋白家族是近年新发现的细胞内信号传导蛋白，能够直接参与转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族成员的信号传导。在对果蝇和Caenorhabditiseleg的研究中发现Mad蛋白和Smad蛋白作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体。特异型的Smad蛋白一过性地与受体直接进行配体结合，接受磷酸化后即与受体分离并与Smad4形成复合体，从而转入细胞核，与其他转录协同子和抑制子共同调节靶基因的转录[1-2]。

    TGF-β超家族成员骨形态形成蛋白受体IA(bone morphogeneticprotein receptor IA，BMPR-IA)，又名ALK-3，在心脏发育和心肌细胞分化中起重要作用。近年来发现ALK-3基因敲除小鼠出现心肌细胞凋亡而导致先天性心脏病，而其下游基因Pax-8在小鼠心脏发育过程中起着重要作用。Smad1/5/8蛋白在ALK-3、Pax-8低表达引起的心肌细胞凋亡中的作用尚未知晓。本研究通过体外研究实验来探索Smad蛋白在基因ALK-3、Pax-8下调中所起的作用。

    1 材料和方法

    1.1 细胞和试剂 H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞株购买自中科院上海细胞库，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养。FBS、0.05%胰酶/EDTA、DMEM/F12、Hanks balanced salt solution购自Gibco；Lipofectamine 2000转染试剂盒、实时定量引物、Trizol试剂、DEPC水(RNase-free and DNase-free)购自美国Invitrogen公司；小鼠抗大鼠β-actin、抗大鼠p-Smad1/5/8抗体、HRP偶联兔抗小鼠IgG抗体购自英国Abcam公司；PCR试剂盒(SYBRGreen Real-time PCR Master Mix)、96孔板及封板膜购自ABI公司；PMSF、RIPA、HRP偶联山羊抗兔抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)购自江苏海门碧云天试剂公司；ECL化学发光显色试剂盒、PVDF膜购自美国Millipore公司；RT试剂盒购自加拿大MBI Fermentas公司。酶标仪ECX800购自Bio-TEX；流式细胞仪购自BD公司。其他试剂均为进口或国产分析纯 ......