卢徐涟，邹阮敏，陈向敏，陈俊，张丽芳，薛向阳

    (1.温州医科大学 微生物学与免疫学教研室、分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 妇产科，浙江 温州 325000；3.温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035)

    宫颈癌是在全世界引起女性死亡的第二大癌症。高危型HPV(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续性感染，尤其是HPV16和HPV18，是引起宫颈癌的重要病因[1]。目前已明确HPV早期癌蛋白E6、E7与抑癌基因p53和pRb之间的E6-p53、E7-pRb调控模式在宫颈上皮细胞癌变过程中起着重要作用[2-3]；此外，E6、E7的表达还可引起宿主基因组的不稳定[4]。HPV基因属于双顺反子或多顺反子，常存在转录后RNA剪切的过程，以消除转录本中非编码的内含子序列[5]。不同的RNA剪切方式可形成不同的转录模式，由此产生差异的编码蛋白。另外，已证实宫颈细胞癌变过程中常存在HPV基因整合，而整合于宿主基因组的病毒基因由于受转录和转录后水平调控的影响，会明显改变病毒基因的表达。目前HPV E6基因转录的检测主要通过普通PCR或Real-time RCR扩增，但是这些方法不能明确E6基因的完整转录本，为此，本研究旨在建立HPV16早期基因E6相关转录本检测方法，以分析宫颈癌不同病变时期HPV16 E6相关转录模式的变化。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 宫颈标本：留取温州医科大学附属第一医院从2010年12月到2012年4月间妇科63例HPV16阳性宫颈肿瘤患者术后组织样本和9例正常宫颈组织，患者年龄25～59岁，平均(42±0.75)岁。根据TBS诊断系统，63例肿瘤样本中，低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)8例、高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)38例和宫颈癌17例。所有患者在术前均未进行放疗、化疗等治疗，且均经阴道镜检查。本研究使用的临床样本已经由患者知情以及医院伦理委员会同意。每例标本离体后10 min内放入RNAlater并置于液氮中保存待后续实验。

    1.1.2 实验试剂：RNAlater购于美国Ambion公司；Trizol试剂购于美国Invitrogen公司；Rnase-free Dnase I试剂盒购于大连Takara公司；RT-PCR试剂盒和KOD plus PCR试剂盒购于日本TOYOBO公司；硝酸纤维素(nitrocellulose ......